色谱法导论

本导图梳理了色谱法的基本原理、色谱基础理论以及定性定量方法的相关知识点，版面整洁且思路清晰，希望对你有所帮助！

色谱法

• 导论
  • 定义
    • 色谱法是一种物理化学的分离分析方法。它是利用样品中各种组分在固定相与流动相中受到的作用力不同（具有不同的分配系数），而将待分析样品中的各种组分进行分离，然后顺序检测各组分含量的一种分离分析方法。
  • 发展历史
    • 吸咐色谱→分配色谱→纸色谱→气相色谱→薄层色谱→高效液相→毛细管电泳→超临界流体色谱
  • 分类
    • 按功能
      • 分析色谱（用于分离分析）
      • 制备色谱（用于物质纯化）
    • 按流动相及固定相的状态
      • Gas chromatography，气相色谱，GC
        • Gas liquid chromatography（气液色谱，GLC）
        • Gas solid chromatography （气固色谱，GSC）
      • Liquid chromatography，液相色谱，LC
        • liquid-liquid chromatography（液液色谱，LLC）
        • Liquid-solid chromatography（液固色谱，LSC）
    • 按固定相形状分类
      • 柱色谱法Column chromatography
        • 毛细管柱色谱Capillary column chromatography
        • 填充柱色谱Packed column chromatography
      • 平面色谱法Plane chromatography
        • 纸色谱Paper Chromatography
        • 薄层色谱Thin Layer Chromatography
        • 薄膜色谱Thin Film Chromatography
    • 按分离机理分类
      • 吸附色谱Adsorption chromatography
      • 分配色谱Partition chromatography
      • 离子交换色谱Ion exchange chromatography
      • 尺寸排阻色谱Size exclusion chromatography
      • 其它
        • 离子对色谱
        • 配合色谱
        • 亲和色谱
    • 色谱法系统分类Systematic classification of chromatography
      • GC
        • Packed column Chromatography
        • Open tubular column Chromatography
      • LC
        • Column Chromatography
          • Classic LC
          • HPLC
        • Planar Chromatography
          • TLC
          • PC
        • Counter-current Chromatography逆流色谱法
      • Supercritical fluid Chromatography （SFC）
  • 色谱法的特点
    • 色谱法是以其高超的分离能力为特点， 它的分离效率远远高于其他分离技术如蒸馏、 萃取、 离心等方法。
    • 优点：
      • “三高”，“一快”，“一广”和“一少”
    • 缺点：
      • 定性能力较差
• 基本概念
  • 色谱过程
    • 指被分离组分在两相中的“分配”平衡过程
    • 以吸附色谱为例
      • 吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→差速迁移→分离
  • 色谱图
    • • 提供信息
        • 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；
        • 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；
        • 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；
        • 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；
        • 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。
    • 色谱峰的对称性
      • • 不对称因子(Asymmetry factor)： 实际色谱很少符合高斯分布，而是具有一定的不对称性。定义不对称因子As来定量地表示色谱峰的不对称程度。
          • 拖尾峰(Tailed peak)： As＞1.05
            • 主要原因是溶质在固定相中存在吸附作用，因此，拖尾峰也称为吸附峰。
          • 伸舌峰(leading peak)： As＜0.95
            • 因为伸舌峰主要是固定相不能给溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。
  • 基线（base line）
    • 概念：只有纯流动相流过，检测信号-时间的曲线（通常为水平线）
    • 基线漂移：操作条件不稳定或探测器及其附件工作状态变化使基线朝一定方向缓慢变化
    • 噪声：偶发因素使基线起伏
  • 峰高（peak height，h）
    • 峰顶到基线距离
  • 区域宽度
    • 衡量色谱柱效率，反映色谱分离的动力学因素；通常希望区域宽度越窄越好。
    • • 表示方法
        • 标准偏差σ
          • 0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半
        • 峰底宽Wb
          • 正态分布色谱曲线两拐点切线与基线相交的截距。Wb=4σ
        • 半峰宽W1/2
          • 在峰高一半处的色谱峰的宽度，单位可用时间或距离表示。W1/2=2.354σ
  • 峰面积（peak area）
    • 峰高（h）乘半峰宽（W 1/2）法
      • • 快速、简便，但不适合于不对称峰、窄峰、极弱峰。
    • 峰高乘峰宽法
      • • 用本方法测得的峰面积约为真实面积的0.98倍。本方法适用于矮宽峰。
    • 峰高乘平均峰宽法
      • • 本方法适用于不对称峰（asymmetrical)
    • 峰高乘保留时间法
      • • 简便、快速，适用于狭窄峰，工厂控制分析。
    • 自动积分和微机处理法
  • 保留值 retention value
    • 是组分在色谱柱中滞留时间的数值，或在柱中滞留时间内所消耗的流动相体积。保留值主要取决于各组分在两相中的分配情况，当条件一定时，任何一种组分都有一个相应确定的保留值。所以，保留值可以作为定性分析的参数。
    • 保留时间tR
      • 指某组分通过色谱柱所需的时间；即从开始进样至柱出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。
    • 死时间t0
      • 不在固定相中滞留的组分从进样开始到其峰顶所对应的时间；即组分在流动相中消耗的时间。
    • 调整保留时间
      • 指扣除死时间t0后的组分保留时间。调整保留时间是组分在固定相中停留的总时间。
    • 保留体积VR
      • 从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大值点时所通过的流动相的体积
    • 死体积V0
      • 不被固定相滞留的组分从柱后流出时所消耗的流动相体积。死体积是柱管内固定相颗粒之间的空隙、色谱仪管路中接头间的空间以及检测器的空间的总和。
    • 调整保留体积
      • 扣除死体积后的组分保留体积
    • 相对保留值relative retention (r2,1 or α)
      • 相同操作条件下，某一组分调整保留值与另一组分调整保留值的比值。相对保留值是色谱定性的依据，它与柱温，固定相性质有关（无量纲）
      • 优点：只要柱温，固定相不变，即使柱径、柱长、填充情况及流动相流速变化，r2,1值仍保持不变，相邻两组分的t’R相差越大，分离的越好，r2,1＝1两组分不能分离。
      • 亦称选择性因子
        • 定性分析中，通常以某一个色谱峰为标准峰(S)，然后求出其它组分峰(i)对标准峰(S)的相对保留值，此时用符号α表示（一般＞1）
  • 分配系数partition coefficient (K)
    • 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（g/mL）比，称为分配系数。
    • 样品一定，K主要取决于固定相性质。温度一定，K越大，出峰越慢；每个组分在各种固定相上的K不同；K=0，不被固定相保留，最先流出。
  • 容量因子capacity factor (k)
    • 容量因子亦称容量比，分配比或质量分配比。温度和压力一定时，组分在两相之间的分配达到平衡时，组分在两相中的质量比，反映了组分在柱中的迁移速率。 k 值一般控制在3-7之间。
    • 分配系数与分配比之间的关系：
      • • 为相比
    • k值也决定于组分，流动相及固定相热力学性质，随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。
  • 分配系数K与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。 容量因子k随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。 分配系数和容量因子都是和组分及固定相的热力学性质有关的常数，都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数。数值越大，保留时间越长。 分配系数可由实验测得。
  • 保留值与分配系数K、容量因子k之间的关系
    • 保留方程：在色谱柱确定之后，固定相体积Vs和流动相的体积Vm都为定值，分配系数K越大的组分在色谱柱中滞留时间越长
    • K或k反映的是某一组分在两相间的分配; 而α是反映两组分间的分离情况!当两组分K或k相同时,α=1时,两组分不能分开;当两组分K或k相差越大时,α越大,分离的越好. 即:两组分在两相间的分配系数不同,是色谱分离的先决条件。
  • 塔板数number of plates（N）
    • 组分在柱中固定相和流动相中反复分配平衡的次数。N越大，平衡次数越多，组分与固定相的相互作用力越显著，柱效越高。
  • 分离度resolution （R）
    • 分离度亦称分辨率，是指相邻两个峰的分离程度。是总分离效能指标，能真实反映组分在色谱柱中的分离情况。
    • 定义：相邻两组分色谱峰保留时间之差与色谱峰峰宽均值之比。
    • 当 R=1.0时，有2%未分离； R=1.25时，有0.6%未分离；R=1.5时，仅有0.3%未分离。
• 理论基础
  • 塔板理论 Plate theory
    • 把色谱柱比作一个精馏塔，是由一系列连续的、相等体积的水平塔板（plate）组成。每一块塔板的高度用H表示，称为理论塔板高度（height of theoretical plates），简称板高。
    • 基本假设
      • ① 柱内各段塔板高度 H不变，柱子塔板数 N = L/H
      • ② 在塔板高度 H 内，组分在两相间达到瞬时平衡。
      • ③ 流动相以脉冲方式进入一个体积。
      • ④ 分配系数K在每个塔板上均不变，是常数。
      • ⑤ 组分加在0号塔板上，轴向扩散（纵向扩散）可忽略。
    • 物理意义
      • N越大，平衡次数越多，组分与固定相的相互作用力越显，柱效越高。
      • 形象地说明了色谱柱的柱效，是反映柱效能的指标。
      • 能很好地解释色谱图，如曲线形状、浓度最大值位置、色谱峰的宽度和保留值的关系等。
      • 当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。
    • 塔板理论的特点和不足
      • 柱效能则越高, 色谱峰越窄
      • 应指明测定所用物质
      • 不能表示被分离组分的实际分离效果
      • 无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果
      • 无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径
    • 塔板理论的局限性
      • 不能解释同一色谱柱对不同组分N或H的不同。
      • 不能解释不同操作条件下，同一色谱柱对相同组分N或H的不同。
      • 不能找出影响N或H的内在因素。
      • 不能为操作与应用色谱方法提供改善柱效的途径和方法。
    • 塔板理论的局限性的产生原因
      • 只考虑组分热力学因素，而没有考虑动力学因素
  • 速率理论 Rate theory
    • 1957年荷兰学者van Deemter（范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论-速率理论(rate theory)。
    • • A－涡流扩散项(Multipath or eddy diffusion)
        • 形成流速不同的流路，造成组分谱带的展宽，亦称多径项。
        • • dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效 n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。
          • 对于空心毛细管柱，不存在涡流扩散。因此 A = 0。
      • B/u－分子扩散项(Molecular diffusion)
        • 组分分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，产生浓度扩散，造成组分谱带展宽。
        • • B-分子扩散项系数
          • γ-弯曲因子（扩散阻止系数）
          • DM-组分在流动相中扩散系数
          • (1) 扩散系数：Dm ∝(M载气)-1/2 ； M载气↑，B值↓。 (2) 柱温↑Dm↑， B值↑；柱压↑Dm↓ ，B值↓; (3) 该项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑; (4) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;
        • 球状颗粒；大分子量流动相；适当增加流速；短柱；低温。
      • (Cs + Cm )u －传质阻力项(Resistance to mass transfer)
        • 流动相传质阻力Cm
          • 溶质分子要从流动相转移到固定相中，就要从流动相主体扩散到气-液、气-固、液-液或液-固界面，阻碍这一扩散过程的阻力称流动相传质阻力。
          • • • k为容量因子；dp 为填充物颗粒的平均直径，Dm为扩散系数。 Cm ∝ dp^2 Cm ∝ 1/Dm
          • GC中采用小颗粒填充物，相对分子质量小的气体（如H2）作载气减小Cm提高柱效；对于填充柱（packed column），固定相含量较高，在中等线速时，Cm 数值较小，通常可以忽略。
          • LC中则采用颗粒小、孔径大的固定相和粘度小的流动相。
        • 固定相传质阻力Cs
          • 溶质分子到达两相界面后，将继续扩散到固定相内部达到分配平衡，然后又返回到两相界面。溶质在这一移动过程中的阻力称固定相传质阻力。
          • • • df-固定相液膜平均厚度 DS-组分在固定液中扩散系数
          • df ↓ k↓ Cs↓
            • 为了df↓ 增加固定相的比表面积
          • Ds↑ Cs↓
    • • 这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了
        • 色谱柱填充的均匀程度,
        • 填料颗粒的大小,
        • 流动相的种类及流速,
        • 固定相的液膜厚度等对柱效的影响
    • 载气流速与柱效
      • 载气流速高时：
        • 传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速↑，柱效↓。
        • 采用低相对分子质量的载气（H2、He），使组分在气相中有较大的扩散系数，以减小气相传质阻力。
      • 载气流速低时：
        • 分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速↑, 柱效↑。
        • 采用相对分子质量大的载气（N2、Ar），使组分在气相中有较小的扩散系数。
    • H - u曲线与最佳流速
      • 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。
      • 以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速uopt。
    • 速率理论公式中A、B、C的求取
      • A、在三个相差较大的流速下，测出三个色谱图。
      • B、在色谱图上选择某个色谱峰，由公式求出三种u下的H。
      • C、由u和H建立三条速率方程，然后求取A，B，C。
  • 扩散理论 Diffusion theory
  • 块状液膜模型 Bulk liquid membrane model
  • 平衡色谱理论 Equilibrium chromatography theory
• 分离度
  • 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。
  • 难分离物质的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：
    • 保留值之差──色谱过程的热力学因素；
    • 区域宽度──色谱过程的动力学因素。
  • • R=0.8：两峰的分离程度89%； R=1：分离程度98%；（基本分离） R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准Standard for absolute separation ）。
  • 色谱分离的前提
    • 推导过程
  • 分离度与柱效能，选择性的关系
    • • a: 柱效项：分离度与柱效的平方根成正比， r21一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。 b：选择性项：增大r21是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当r21增加一倍，需要的n有效减小10000倍。增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。 c：柱容量项：k大一些对分析有利; 太大，tR长，柱容量合适,分的才好。 一般１＜k＜10
• 定性定量分析
  • 色谱定性鉴定方法 Qualitative methods
    • 1. 利用纯物质定性的方法Based on chromatographic retention value by pure substance
      • 利用保留值定性
        • 不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比
      • 利用加入法定性
    • 2. 利用相对保留值r21定性According to the relative retention value
      • 相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。
      • 用保留值定性时，必须使两次分析条件完全一致，有时不易做到。而用相对保留值定性时，只要保持柱温不变即可。
    • 3. 利用双色谱系统定性According to the dual chromatography system
    • 4. 保留指数According to the retention index
      • 是一种重现性比其他保留数据都好的定性参数。可根据所用固定相和柱温直接与文献值对照，而不需标准样品。
    • 5. 利用选择性检测器定性或离线结构分析
    • 6. 与其他分析仪器联用的定性方法
  • 色谱定量分析方法Quantitative analysis methods
    • 1. 峰面积的测量 Peak area measurements
      • 峰高（h）乘半峰宽（W 1/2）法
        • • 快速、简便，但不适合于不对称峰、窄峰、极弱峰。
      • 峰高乘峰宽法
        • • 用本方法测得的峰面积约为真实面积的0.98倍。本方法适用于矮宽峰。
      • 峰高乘平均峰宽法
        • • 本方法适用于不对称峰（asymmetrical)
      • 峰高乘保留时间法
        • • 简便、快速，适用于狭窄峰，工厂控制分析。
      • 自动积分和微机处理法
    • 2. 定量校正因子Quantitative calibration factor
      • 绝对校正因子
      • 相对校正因子
    • 3.常用的几种定量方法Quantitative calculation methods in common use
      • （1）归一化法Normalization method ：
        • • 归一化法简便、准确；
          • 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；
          • 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。
      • （2）外标法External standard method
        • • 外标法不使用校正因子，准确性较高。 操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。
      • （3）内标法Internal standard method
        • 内标物要满足以下要求：
          • （a）试样中不含有该物质；
          • （b）与被测组分性质比较接近；
          • （c）不与试样发生化学反应；
          • （d）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。
        • 试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS
        • 内标标准曲线法（Internal standard curve method)
        • 内标法特点
          • (a)适用于仅需测定部分组分或试样中其它组分不能全部出峰的情况
          • (b)可消除由于操作条件变化而引起的误差，内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。
          • (c) 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。
          • (d) 若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：