导图社区 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术的思维导图。从概念、核酸探针、分子杂交信号检测、经典杂交技术、DNA芯片、影响杂交信号检测的因素几个方面的介绍。
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核酸分子杂交技术
概念
指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链杂交体的过程
核酸探针
种类
DNA探针
最常用的核酸探针，通常为400~500个碱基
优点
这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备方法简便
相对不易被降解，一般DNA酶活性能有效地被抑制
标记的方法较成熟，有多种方法可供选择
RNA探针
可以是标记的分离的RNA，但常常是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转入产物
细胞mRNA探针和病毒RNA探针标记效率不够高，且受多种因素限制，主要用于研究而不是临床检测
寡核苷酸探针
一般由17~50个核苷酸组成
标记
标记物的选择
放射性标记
优点：可以准确定量；灵敏度高；本底低；易于除去旧探针，重新杂交新探针
缺点：短半衰期的探针需临用前制备；放射性递减使用探针降解；放射线物质对人体有害；费用贵
非放射性标记
优点：对人体危害小；稳定，可供长时间内持续使用；检测过程快；可同时进行不同探针的杂交；本底较低
缺点:灵敏度不如放射性探针；杂交条件受报告基因的限制；重新杂交新探针比较困难
标记方法
1、随机引物标记
2、DNA缺口平移标记
3、全程RNA探针标记
4、化学法全程标记
5、3’末端标记
6、5’末端标记
分子杂交信号检测
放射性标记探针检测
放射自显影
直接放射自显影
间接放射自显影
液体闪烁计数法
非放射性标记探针的杂交检测
酶促显色检测
直接检测
碱性磷酸酶
辣根过氧化物酶
间接检测
荧光检测
化学发光检测
多探针检测
经典杂交技术
固相杂交
反向杂交
定义
将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA用互不干扰，故不能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法一次仅能检测出一个未知序列。
应用
基因分型检测
Southem印迹杂交
技术过程
一、将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹。
二固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
单基因遗传病的基因诊断
基因点突变的检测
Northern印迹杂交
应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术
RNA病毒检测
基因表达的检测
菌落杂交
点/狭缝杂交
液相杂交
指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。
然后
特点
不需要支持物
类型
吸附杂交
发光液杂交
液相夹心杂交
复姓速率液相杂交
原位杂交
应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在新的境下进行细胞内定位的检测技术。
DNA芯片技术
影响杂交信号检测的因素
1、探针的选择
2、探针标记的方法
3、探针的浓度
膜杂交中：放射性 5~10ng/ml 非放射性25~1000ng/ml
原位杂交：0.5~5.0ug/ml
4、杂交率
5、杂交温度
温度越高杂交的速率也快
6、杂交的严谨性
7、杂交反应时间
8、杂交促进剂
