核酸分子杂交技术

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核酸分子杂交技术

• 基本原理
  • DNA变性和复性
  • 变性
    • 在某些理化因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程称为核酸的变性。
    • 核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，但并不涉及共价键的断裂
    • 变性方法
      • 热变性、酸碱变性、化学变性剂
    • 增色效应（hyperchromicity）由于DNA变性而引起的光吸收增加的现象
    • 结构：螺旋→线团
    • 理化性质：紫外吸收↑ ，粘度↓ ，比旋光度↓
    • 生物活性：↓或丧失
    • DNA的融点（或熔解温度，Tm）DNA分子的一半发生变性时的温度为Tm。DNA分子的变性是一个爆发过程，变性作用发生在一个很狭窄的温度范围（6～8℃），变性曲线为双曲线。
  • 复性
    • 指变性DNA分子在适当条件下，两条彼此分开的链自发重新缔合成为双螺旋结构
    • 复性过程：成核作用；拉拉链作用
    • 复性条件
      • 1||| 足够的盐浓度，0.15～0.50mol/L
      • 2||| 合适的温度：比Tm低20～25℃
      • 3||| 样品的性质
      • 4||| DNA的浓度
      • 5||| DNA片段的大小
    • 理化性质: ↓ 比旋光度↑ 粘度↑
• 核酸分子杂交
  • 概念
    • 不同来源的、序列互补的单链RNA、DNA或DNA和RNA，根据碱基互补原则，借助氢键连接为双链分子的过程。
  • 概念： 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。
  • 类型
    • 单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA）
    • 单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA）
    • 单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）
  • 影响因素
    • 核酸探针的种类，浓度，长短，标记方法
    • 杂交条件的影响
    • 杂交率
    • 待测样本和靶序列的特性
  • 目的：就是运用特异性探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段
• 核酸探针(Probe)
  • 概念
    • 用放射性核素或其他活性物质标记的能检测靶分子的已知核酸序列
  • 性质
    • 带有标记的某一特定DNA/RNA片段， 可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA也可是RNA
  • 分类
    • 基因组探针
      • 从已建立的基因组文库中筛选和分离所需目的基因
    • DNA探针
      • 最常用的探针
    • cDNA探针
      • 从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针
        • cDNA：指与mRNA互补的DNA链
    • RNA探针
      • 降低非特异性杂交
    • 寡核苷酸探针
      • 根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段，通过分子克隆制备
  • 标记
    • 将探针标记上一种标识物以便杂交后检测
    • 常用于标记探针的物质
      • 同位素：32P , 35S , 3H-dNTP等；
      • 非同位素：地高辛配体、生物素、酶、荧光素。
    • 常用的标记方法
      • 缺口平移法
        • 利用大肠杆菌DNA聚合酶的3'-5'聚合酶活性与5'-3'外切酶活性，将标记的dNTP掺入新合成的探针中的方法
        • ①在DNaseⅠ的作用下，制造一些缺口， ②利用DNA聚合酶 I Ⅰ5’→3’外切酶活性，在缺口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸； ③同时DNA聚合酶 Ⅰ有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。 ④随着反应的进行底物中被标记的单核苷酸，随机掺入 ⑤DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记
        • 活性高，标记均匀
        • 但无法精确控制探针长度，较短
      • 随机引物法
        • 利用E coliDNA聚合酶的klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链， kelnow具有5’→ 3’聚合酶活性。
        • ①被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。 ②在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。③反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。
      • 聚合酶链反应标记DNA探针
        • 利用Taq DNA聚合酶和标记的dNTP，以起始模板合成高比活性的双链或单链DNA探针。
        • 简便快速、效率高、重复性好，可大量制备
      • 末端标记法
        • 5’末端加成标记法
          • 先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5’-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 的γ-磷酸转移加到DNA片段5’-OH上。
        • 3’末端加成标记法
          • 在探针3’-末端用末端转移酶掺入一个带标记的[α-32P]dNTP。
        • T4聚合酶替代法
      • RNA探针标记
        • 体外转录技术
        • RNA探针具有高放射活性，主要用于Northern杂交、原位杂交和RNase保护分析
      • 非放射性标记
        • 优点：稳定，安全，经济，实验周期短
        • 缺点：敏感性及特异性不及放射性标记
        • 常用：地高辛配体、生物素、酶、荧光素
        • 标记方法：
          • 酶促反应标记法
            • 将标记物预先标记在单核苷酸分子上， 利用酶促反应将核苷酸分子掺入到探针中
            • 灵敏度高，制作复杂，成本较高
          • 化学修饰标记法
            • 标记物分子上的活性基因与探针分子上的基团发生化学反应
            • 简单，快速，标记物分布均匀
            • 常用：生物素、光敏生物素、地高辛、酶标、荧光素标记核苷酸探针
  • 纯化
    • 凝胶过滤法
      • 利用凝胶分子筛特性
    • 乙醇沉淀法（首选）
      • DNA片段可被无水乙醇沉淀
  • 检测
    • 放射性核素探针的检测：放射自显影法和液体闪烁计数法。
    • 非放射性探针的检测：与标记物的种类有关，大致分为直接法和间接法
• 核酸分子杂交类型
  • 液相杂交
    • 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；
  • 固相杂交---最为常用
    • 待测核酸样本先结合到固相支持物上， 再与溶液中的特异性探针进行杂交反应，因而可有效避免靶DNA的自我复性、操作简便，误差较低。
    • 常用固相杂交支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜等
  • 固相杂交的分类
    • Southern印迹杂交
      • 原理：将待测DNA分子用限制性核酸内切酶消化后 通过电泳进行分离，将其变性 原位转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上 固定后再与标记的DNA/RNA探针进行反应
      • 步骤：样品准备，印迹，杂交
        • 印迹：将变性的DNA片段从胶上转移至固相支持物上的过程
          • 印迹的方法：毛细管转移法、电转移法和真空转移法
    • Northern印迹杂交
      • 提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号
      • Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA
    • 斑点杂交
      • 在Southen印迹杂交基础上发展起来的快速检测特异核酸分子的杂交方法
      • 制样品→点样→固定
    • 原位杂交
      • 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，检测特异DNA，RNA序列
      • 固定→通透→预杂交→杂交→检测
      • 优点：不需提取核酸，可完整保持组织或细胞的形态，更能准确地反映组织细胞的功能状态
    • 染色体原位杂交
      • DNA探针✖染色体上的DNA
      • 在染色体上直接进行检测
    • 荧光原位杂交(FISH)
      • 利用非放射性荧光信号对原位杂交样本进行检测
      • 探针制备与标记→杂交样品准备→原位杂交→信号处理与检测
      • 应用：产前诊断.肿瘤的诊断和预后判断.白血病等恶性疾病的机制研究.病原体检测