酶的定向进化

科学出版社《酶工程》第四版第八章酶的定向进化笔记，包括酶定向进化特点、酶基因的随机突变、定向突变的应用、突变文库的建立及筛选等。

酶的定向进化

• 酶定向进化特点
  • 1）自然进化 不可控的随机突变和重组（突变几率小）+自然界定向筛选（筛选方向由外界环境确定） 2）人工进化 人工控制的随机突变（突变几率大，但突变基因不可知）+人工定向筛选 （筛选方向人工确定） 3）定向进化 人工控制的单基因突变（突变或重组基因可选定）+人工定向筛选（筛选方向人工确定，通常用高通量筛选）
  • 适应面广:P酶、R酶
  • 目的性强∶人工控制条件筛选
  • 效果显著:能在短时间内获得自然界需要长时间完成的进化
  • 定向进化相对于自然进化，点突变多，其它突变类型少
• 酶基因的随机突变
  • 
  • 易错PCR
    • 该方法是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。
    • 特点：操作简便，随机突变丰富；正突变概率低，突变基因文库较大，筛选工作量大；适合较小基因(<800bp )的定向进化
  • DNA改组
    • 该方法是从两种以上的同源正突变基因出发，用酶切成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。
    • 基本操作过程: (1)靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲本基因群,用DNase Ⅰ随机切割; (2)得到的片段经过不加引物的多次PCR循环,在该过程中,这些片段之间互为引物和模板进行扩增,直至获得全长基因; (3)再加入基因的两端引物进行常规PCR,最终获得发生改组的基因库。
    • 特点：正突变体概率高，进化速度较快；在获得全长基因之前要除去DNase 1
    • DNA重排技术的改进
      • 交错延伸PCR技术
      • 随机引物体外重组技术
  • 基因家族重排技术
    • 该方法是从基因家族的若干同源基因出发，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR扩增，使DNA碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。
• 定向突变的应用
  • 提高酶的催化活性：是定向进化的主要目标之一
  • 增强酶的稳定性
    • 分子修饰
    • 固定化
    • 非水相介质催化
    • 定向进化
  • 改变酶的底物特异性：影响酶对底物的Km值，进而改变底物特异性
• 突变文库的建立及筛选
  • 文库的建立
    • 构建基因文库的质量要求
      • 文库的包容性
      • 文库的完整性
    • 构建突变基因文库的主要过程
      • 载体的选择
        • 质粒载体
          • 有自主的复制起点；两种以上的易于检测的选择性标记；多种限制性内切核酸酶的单一酶切位点；适合小片段DNA的重组
        • 噬菌体DNA载体
          • 最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库
        • 黏粒载体
          • 常被用来构建高等生物基因文库
        • 噬菌粒载体
      • 基因重组
        • 黏性末端连接
        • 平头末端连接
        • 修饰末端连接
      • 形成基因文库
  • 突变基因的筛选
    • 根据定向进化的目的要求，在一定的环境条件下进行筛选，从突变基因文库中选取得到所需的突变基因
    • 传统筛选
    • 高通量筛选
      • 平板筛选法
        • 依据细胞生长情况筛选突变基因
        • 显色圈筛选
        • 根据透明圈情况筛选突变基因
      • 荧光筛选
      • 噬菌体表面展示技术
      • 细胞展示技术
        • 酵母表面展示法Yeast Surface Display
          • 酵母展示技术用于疫苗
          • 酵母展示技术用于酶
        • 细菌细胞表面展示法 Bacterial Cell Surface Displa
          • 革兰氏阴性菌表面展示技术
          • 革兰氏阳性菌表面展示技术
      • 核糖体展示技术
        • 是在体外合成、筛选和展示蛋白质的新技术
        • 应用于功能蛋白、多肽及酶分子定向进化改造等领域
      • 乳液-荧光
      • 量热筛选
        • 优点:是一种新颖的有发展前途的高通量筛选技术。它不需要生色基团或荧光基团的加入，避免了比色和荧光检测方法的局限性。
        • 缺点:目前还无法定量，只能检测催化活性较高的酶，对酶活的进一步研究还需借助传统方法，方法本身还需要进一步的发展和完善。