基因工程的基本操作程序

关于基因工程的基本操作程序的思维导图，包括目的基因的筛选和获取、表达载体的构建、将目的的基因转入受体细胞这三个方面的内容介绍。

基因工程的基本操作程序

• 目的基因的筛选和获取
  • 例子：Bt抗虫基因，Bt抗虫蛋白被分解成多肽，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔使害虫死亡
  • PCR技术
    • 原理：DNA半保留复制的原理
    • 材料：2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶
    • 过程
      • 变性：温度超过90℃，双链DNA解聚成单链
      • 复性：温度下降到50℃两种引物碱基互补配对与两条dna'结合
      • 延伸：当温度上升到72℃，在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链
      • G/C比例越高变形所需温度越高
    • 计算：1个模板DNA经过n轮PCR扩增出2的n次方个DNA片段，共需引物2的n+1次方-2个
    • 鉴定：琼脂糖凝胶电泳
    • 扩增mRNA
      • 单链RNA（逆转录酶）杂交双链（核酸酶H）单链DNA（DNA聚合酶）双链DNA（cDNA）
    • tips
      • 在含Mg2+的缓冲液中进行→激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
• 表达载体的构建
  • 过程
    • 先用一定的限制酶切割载体，再用能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段再利用DNA连接酶将目的基因拼接到载体的切口处
  • 单酶切缺点
    • 质粒重新环化
    • 目的基因自身环化
    • 质粒和目的基因反向连接
  • 双酶切优点
    • 阻止
  • 特定结构
    • 启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
    • 终止子：使转录在所需要地方停止
• 将目的基因转入受体细胞
  • 花粉管通道法
    • 我国科学家独创
    • 过程：花粉落到柱头刺激花粉管生长至子房→滴管蘸取外源DNAaq涂抹到雌性柱头→外源DNA沿花粉管通道进入胚囊→外源DNA进入受精卵→DNA随机整合
  • 农杆菌转化法
    • 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
    • 农杆菌含有Ti质粒：当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞上并整合到该细胞的染色体DNA上
    • 两次拼接
      • 目的基因转到T-DNA上
      • T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上