药用植物分子鉴定

细胞悬浮培养（从愈伤组织液体培养基础上发展起来的培养技术）：在培养过程中，每隔一定时间更换一部分培养液或添加某种营养成分。

药用植物细胞培养

• 定义：是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基（悬浮培养）中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的一种技术。
  • 选择的培养基在培养过程使细胞总体积倍增时间1天左右为宜
• 优点：
• 植物单细胞培养
  • 意义：
  • 分离途径
    • (1)从外植体直接分离单细胞
      • 方法：外植体经过切割、捣碎（机械法）或酶解（酶解法），然后经过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。
      • 特点：悬浮液中所含的完整细胞数量较少，但分散性好
      • 分离单细胞的最好材料：叶片
    • (2)从愈伤组织分离单细胞
    • (3)通过原生质体再生法获得单细胞
  • 单细胞的培养方法
    • (1)平板培养
      • 定义：将一定量悬浮细胞接种或混合到到装有一薄层未固化培养基的培养皿内进行培养的方法（固体培养基）（暗培养）
      • 方法
        • （1） 单细胞悬浮液的制备
        • （2） 单细胞悬浮液的密度调整： 最适密度：细胞密度应调整为103~105个 /ml 调整方法： ①如果密度过大，加入液体培养基进行稀释； ②如果密度过小，通过低速离心使细胞沉降后，再吸取液体培养液，减小液体培养基的体积。
        • （3） 固体培养基的配制：固体培养基使用和在悬浮培养中或愈伤组织培养中成分相似的培养基
        • （4） 单细胞悬浮液与固体培养基等量混合（细胞均匀分布）（观察细胞植板率）
        • （5） 暗培养（减少镜检）
        • （6） 继代培养（单细胞形成的细胞系）
      • 优点：
        • （1）单细胞在培养基上均匀分布，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选常用方法。
        • （2）该方法可用于细胞分裂分化、遗传变异、生理生化研究及次生代谢物合成等。
      • 缺点：通气性不好，代谢排泄物质易积累造成毒害和影响细胞对营养的吸收
    • (2)看护培养
      • 定义：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法；
      • 方法：将单细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织上培养。
      • 程序：（无菌滤纸，固体培养基）
      • 原因是：
        • 1.愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息
        • 2.愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件
      • 优点：简便、成功率高
      • 缺点：不能在显微镜下直接观察细胞分裂、生长过程
      • 适用于难于培养的植物种类
    • (3)液体浅层培养
      • 方法：先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。
      • 优点：
        • 1.培养物与空气接触面大，通气性好；
        • 2.细胞代谢有毒产物容易扩散，不会造成有害物质的危害；
        • 3.继代培养方便、便于观察。
      • 缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察
    • (4)微室培养（微滴培养）
      • 优点：有利于对单个细胞的生长、分裂、分化等情况进行连续观察，全程跟踪研究。
      • 缺点：通气性差，水分易蒸发，pH易变动，不利于单细胞的持续培养
• 细胞悬浮培养 （从愈伤组织液体培养基础上发展起来的培养技术）
  • 优点：
  • 建立悬浮培养的关键技术
    • 愈伤组织的诱导与起始培养物的建立:
    • 悬浮培养中细胞生长情况分析:
    • 悬浮培养细胞的同步化
      • 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期（G1期，S期，G2期和M期）
      • 方法：
    • 成功的悬浮细胞培养体系的标准：
  • 培养方法
    • 分批培养法
      • 意义：是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。
      • 将植物细胞在一定容积的密闭容器中进行培养。是一种封闭的培养体系，培养过程中不放出培养液，也不补加培养液；
      • 要进行下一批培养，则须在细胞生长一定时间后，进行继代转移
      • 特点：
      • 最佳继代时期　选择处于对数生长期和直线生长期的细胞
      • 继代培养操作注意事项：
    • 半连续培养法
      • 在培养过程中，每隔一定时间更换一部分培养液或添加某种营养成分
    • 连续培养法
      • 通过控制连续添加和排出的新老营养液的量，维持培养液体积恒定
      • 分类：
  • 影响悬浮细胞生长的因素：
  • 细胞的保存：
• 规模化细胞培养
  • 规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径
  • 生物反应器：指为细胞生长提供合适的化学和物理环境并能检测、控制细胞生长的装置
  • 生物反应器培养过程
    • （1）细胞的驯化、筛选与细胞株的建立
    • （2）扩大培养（细胞株鉴定）
    • （3）生物反应器培养
  • 影响生物反应器细胞培养的主要因素
    • （1）细胞遗传特性
    • （2）培养的环境条件
  • 生物反应器培养系统
    • 悬浮培养系统
    • 固定化培养系统
      • 特点：细胞固定而培养液循环流动
      • 分类
        • （1）包埋式固定化培养系统
        • （2）附着式固定化培养系统
  • 两相培养技术
    • 在培养体系中加入脂溶性有机物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长和合成次生物质，次生物质分泌出来转到有机相中