导图社区 基因工程的基本操作程序
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基因工程的 基本操作程序
目的基因的筛选与获取
从基因文库中获取
基因组文库
含所有遗传信息
cDNA文库
mRNA逆转录为DNA（无内含子）
文库上无启动/终止子 质粒上有
人工合成
逆转录法
化学合成法
PCR技术 （聚合酶链式反应）
原理
DNA半保留复制（体外复制）
原料
高温（替代解旋酶）
耐高温的DNA聚合酶
2种引物
n轮：2∧n+1 -2个
DNA母链
4种脱氧核苷酸dnTP
Mg²+ pH缓冲液
过程
变性
＞90℃ 双链—解聚→单链
复性
50℃ 引物结合
延伸
72℃ 互补配对形成新链
区别
方式
PCR 完全解旋→半保留全连续复制
细胞核内 从链中间解旋→半保留半不连续复制
引物
PCR DNA片段保留在复制子链
细胞核内 RNA片段 脱落
基因表达载体的构建
最重要
载体组成
目的基因
启动子
RNA聚合酶结合位点 转录开始
起始密码子：RNA上启动翻译
终止子
标记基因
检测目的基因是否导入细胞
复制原点
DNA聚合酶结合位点
方法
双酶切法
产生不同黏性末端
避免
目的基因自身环化
目的基因反向连接
产生同种黏性末端
作用
酶切位点可选择范围增大
避免目的基因本身被切断
目的基因导入受体细胞
植物细胞
花粉管通道法
注射DNA溶液于子房中
剪去柱头→花粉管通道进入囊胚
农杆菌转化法
目标
双子叶和裸子植物
不能侵染大多数单子叶植物
步骤
双酶切在Ti质粒 T-DNA导入目的基因
Ca2+处理农杆菌 吸收Ti质粒
农杆菌侵染植物细胞
T-DNA转移到植物细胞， 整合到植物细胞染色体DNA
2次转化
质粒进入农杆菌
农杆菌中质粒进入受体细胞
2次拼接
目的基因接在Ti质粒T-DNA上
T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上
动物细胞
显微注射法
注入最大 全能性最强细胞→受精卵
微生物细胞
Ca2+处理法
变为感受态细胞吸收DNA∵改变细胞膜通透性
目的基因的检测与鉴定
是否插入基因
PCR等技术（DNA分子杂交）
电泳+基因探针+显影
mRNA是否转录
PCR等技术（分子杂交技术）
蛋白质是否翻译
抗原-抗体杂交
分子水平
是否有性状
抗性接种实验
个体水平
DNA片段的扩增及电泳分离
DNA的热变性原理
电泳
向+极移动
迁移速率 凝胶浓度、DNA分子大小和构象
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料
预变性：使DNA充分变性 引物更好地和模板结合
注意事项
留一个加样孔→加入指示分子大小的标准参照物
指示剂前沿迁移接近凝胶边缘→停止电泳
紫外灯下观察→一条条带 无拖尾
有拖尾
漏加PCR反应成分
各反应成分用料不当
有多条带
引物设计不合理，与非目的序列有同源性
微量离心管、枪头、蒸馏水→高压灭菌处理
吸取不同试剂→枪头要更换