导图社区 微生物遗传与食品微生物的菌种选育
微生物遗传学是以病毒、细菌、小型真菌以及单细胞动植物等微生物为研究对象的遗传学分支学科。微生物有 微生物遗传学个体小、生活周期短、常能在简单的合成培养基上迅速繁殖等特点,并且可以在相同条件下处理大量个体,所以是进行遗传学研究的良好材料。微生物遗传学在20世纪40~50年代的发展,促进了遗传学中一些基本理论的阐明;50~60年代推动了分子遗传学的发展。
编辑于2022-06-07 20:36:24微生物遗传与食品微生物的菌种选育
遗传
遗传&变异
遗传
相对
亲代与子代间的相似性
遗传型
表型
变异
绝对
遗传与变异相互促进,相互制约
物质基础
经典实验
肺炎链球菌的转化实验
受体细胞直接摄取DNA,整合入自身基因组, 获得供体的某些遗传特性
转化
直接摄取DNA片段,互补配对原则,整合至受体基因
噬菌体感染实验
DNA是遗传物质
同位素标记法
病毒重建实验
烟草花叶病毒&霍氏车前草花叶病毒分离重建
RNA
病毒只能含一种核酸
存在形式
核染色体(核基因组)
原核染色体
拟核,环状,1个
单纯的DNA或RNA
高度折叠
有磷酸根,带负电
镁离子
有机碱:精胺、亚精胺、腐胺
真核染色体
DNA+组蛋白→核小体
核外染色体 (广义质粒)
真核的“质粒”
细胞质基因(质体)
通常呈环状
线粒体
叶绿体
中心体
动体
共生生物
卡巴颗粒
酵母菌的质粒
无表性效应
原核的质粒
除拟核外,共价、环状、闭合双链DNA
类型
严禁型
随染色体DNA复制
松弛型
基因工程中的应用
对生命活动无决定性作用, 提供竞争优势
分子量小,便于分离和操作
环状,化学分离过程中保持性能稳定
具有复制子,在宿主细胞内独立复制
拷贝数高,使外源DNA很快扩增
选择性标记
代表类型
F质粒
接合在供体核受体间——传递遗传物质
大肠埃希菌
R质粒
抗性
肠道细菌、链霉菌
Col因子
细菌素,杀死周围其他细菌
大肠埃希菌
Nisin——食品保藏,防腐剂
Ti质粒
破坏控制细胞分裂的激素调节系统
侵入性
诱导双子叶植物癌症,根癌农杆菌
Ri质粒
发根
巨大质粒
固氮
根瘤菌
病毒
RNA或DNA
单链或双链
环状或线状
都不与蛋白质结合
微生物的基因重组
基因重组
AKA遗传传递
不同来源的遗传物质,交换与重新组合→新的基因型→新遗传型个体
特点
后代:特异性、与亲代不同
与变异的区别
重组不发生任何碱基对结构上的任何改变
类型
真核生物
有性杂交
性细胞间接合,基因重组,新遗传型后代
有性孢子
减数分裂
准性生殖
不通过有性生殖的基因重组过程
不产生有性孢子
同一生物不同来源体细胞,不通过减数分裂,低频率基因重组
过程
菌丝联合——异核体
核配,杂合二倍体
体细胞重组
半知菌
细菌
转化
受体菌吸收来自供体菌的遗传物质,交换组合把DNA片段 整合到受体菌基因组,获得新的遗传性状
转化后的受体菌:转化子
供体菌DNA片段:转化因子
必备条件
感受态
从环境中接受转化因子的状态
自然感受态
遗传
生理
环境
人工感受态
氯化钙处理
电穿孔:高压脉冲电流
cAMP
细胞壁、膜上有孔
转化因子的结合、吸收和整合
任何状态都能吸附DNA,感受态能吸收
转化因子分子量大于30万,转化时一条链进入细胞, 另一条链被细胞表面的核酸外切酶彻底降解
过程
感受态出现
转化因子的吸附与掺入
双链DNA+DNA结合蛋白→吸附于表面
细胞表面有特定位点
核酸酶切成缺口
降解为一条单链
单链+感受态特异蛋白→进入细胞
耗能
转化因子的整合
单链与受体菌DNA同源区重组
受体菌单链降解
复制后,杂合区段分开,一个类似受体菌,另一个类似供体菌
细胞分裂,染色体分离,转化子形成
影响因素
感受态
是否能进入
限制酶系统
转化因子是否分解
同源性
是否整合
比如
原核(普遍)
肺炎链球菌
芽孢杆菌
葡萄球菌
嗜血杆菌
x单胞菌
真核
酵母
黑曲霉
接合
细胞直接接触——性菌毛,遗传信息转移和重组
接合子
受体细胞
结合机制
大肠杆菌F因子
雌雄之分,F为雄性
F:致育因子,促使接合,是一种质粒
自主地与细菌染色体同步复制并转移
可脱离染色体独立存在
可整合到染色体基因组
可通过接合而获得,也可从细胞中消除
遗传组成
原点:转移的起点
致育基因群
配对区域
四种细胞形式
会画图
F-
不含F
雌性
F+
含游离F
Hfr
高频重组菌株
染色体特定位点整合
F'
可整合至染色体,也可脱落
脱落时会携带一小段核DNA
杂交
F+&F-
性菌毛
F因子出现缺口,双链之一切断,断裂单链经性菌毛转移至F-
F-复制新F因子,形成两个F+
速度快
获得F+
F'&F-
F不支持切割获得一小段基因,整合紧F-
次生F'菌株
Hfr&F-
产生接合管
Hfr染色体在F因子处发生断裂(F位于末端)
线状染色体从头部开始进入受体菌
前端基因进入受体菌的概率更大
F因子不一定能完全进入F-
形成新的重组型,但不一定能形成Hfr
重组频率高
转导
比转化普遍
噬菌体为媒介,供体遗传物质转至受体,受体出现供体的部分遗产物质
类型
普遍性转导
基因随机
噬菌体误包供体菌任何基因(质粒)。使受体菌实现各种形状转导
组装错了,10^-6~10^-8
转导型噬菌体
能实现普遍转导的噬菌体含有一个使供体菌染色体断裂的酶
后果
流产转导
无反应
转导失败
核酸酶降解
完全转导
外源DNA与受体DNA重组→稳定转导子
特异性转导 (局限转导)
整合位置相对固定
温和噬菌体,整合至特定位点(宿主细胞溶源化), 整合基因不正常切除,噬菌体获得供体基因
转导基因相对固定,与噬菌体基因共价结合
噬菌体
溶源转变
区别
温和噬菌体自身基因导入,不携带任何供体菌的基因
温和噬菌体完整
菌种的保藏和复壮
菌种衰退
表现出负变性状
基本原因
变异
现象
形态改变
生长缓慢
目标代谢产物改变
防止
合理育种
尽量使用单核细胞
合理选择诱变剂种类、剂量,增加突变位点→减少分离回复
诱变后充分培养、分离纯化,保证菌种纯粹
良好培养条件
控制传代次数
不同类型细胞移种传代
放线菌、霉菌菌丝体多核,用单核的孢子更好
冻干
复壮
方法
纯种分离
单细胞培养
扩大培养
寄主型微生物可接种到寄主体内以提高活力
联合复壮
诱变
定义
利用自发突变不断从生产中进行选种工作
保藏
低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂、酸度中和剂+优良纯种→休眠体: 代谢不活泼,生长受抑制
具体方法
生活态→传代培养
培养基内连续移种法
宿主活体连续移种法
休眠态
干法
固体媒介
粒状载体
土壤
沙粒
球块状载体
硅胶
瓷球
片状载体
滤纸片
硅胶蜡纸板
血清蛋白聚乙烯
醋酸纤维素膜
封入小试管,再放入大试管干燥器
封入安瓿瓶
菌液真空干燥
冷冻真空干燥
湿法
固体斜面
半固体琼脂柱
液体媒介
蒸馏水
糖液
甘油
石蜡覆盖
食品微生物的菌种选育
应用
菌体直接应用
代谢物应用
酶及产物
腐乳
菌种
保藏机构、科研单位、工厂获取
自然界分离
育种、改良
保持、复壮
自然选育
设计试验方案
采样
原始生境相似性
根本来源是大自然
增殖培养
原理
选择物质:营养成分、抑制剂
控制培养条件
种类
细菌
抗真菌剂
放线菌
天然浸出汁:增殖因子
放线菌可有效利用低浓度底物核复杂底物(几丁质)
抗真菌剂
真菌
低C/N
抗生素
较低的pH
分离纯化
筛选
首先要获得纯的野生型菌株
产物
菌体
目标产物鉴定
原初菌珠
安全性评价
毒性实验
诱变育种
步骤和方法
出发菌株的选择
自然界直接分离
对诱变剂敏感
生产中自发突变、长期驯化所得
多选几株,提高概率
同步培养
易变异,重复性好
对数生长期的细菌
霉菌分生孢子,活化状态但未形成菌丝体
亚硝基胍:作用于复制叉
单细胞(孢子)菌悬液制备
分散均匀
充分接触诱变剂
诱变处理
化学
物理
紫外线最常用
诱变剂量
剂量存活曲线
剂量-诱变率曲线
最适剂量
高变异率基础上扩大变异幅度
中间培养
表现迟滞
细胞内原酶的量的稀释过程
液体培养基中繁殖3代以上才能获得突变性状
培养、复制、纯变异细胞
分离和筛选
初筛
培养尽可能多的菌株,预先设计相同培养条件
主要是量,减少漏筛机会
复筛
主要是质
反复多次
营养缺陷型突变体筛选
培养基
基本培养基MM
满足野生型的最低成分
完全培养基CM
满足所有营养缺陷型
添加富含各种营养素的天然有机物质
补充培养基SM
有针对性地添加集中有机营养成分
过程
诱变
营养缺陷型比例一般很低
淘汰野生型
浓缩
基本培养基
抗生素法
野生菌株在MM上生长,加入诱变剂,野生型活化而营养缺陷型休眠
加入抗生素,杀死活化的野生型,留下缺陷型
细菌:青霉素
酵母:霉菌素
菌丝过滤法
野生孢子萌发产生菌丝,营养缺陷型仍然是孢子
过滤除去野生型
目标检出和鉴定
影印法
诱变处理后完全培养基培养
灭菌丝绒轻按
转接至基本培养基
观察两个培养基上菌落的的差异,基本培养基上没长的就是营养缺陷型
夹层培养法
基本培养基层1+基本培养基层2+完全培养基层
先用基本培养基培养,标注长出的菌落,再加CM/SM,看谁是新长的
缺陷
结果不明确
不易挑出菌落
逐个检出法
单菌落一分为二
分别接种MM/CM
限量补充培养法
0.01%以下蛋白胨
野生型迅速长成大菌落
营养缺陷型生长缓慢,菌落小
确定生长谱
确定哪种营养缺陷
方法
滤纸片法
倾注平板法
平板上放置沾有不同营养素的滤纸片
划线法
配置含有不同营养素的培养基
应用
微生物分析法
营养缺陷型菌株定量分析各种生长因素
一定浓度范围内,生长繁殖数量与其所需维生素、氨基酸成正比
分析食品中维生素、氨基酸含量,特异性强、灵敏度高
研究遗传规律的标记菌种
测定微生物代谢,控制微生物代谢途径
杂交育种
两个基因型不同的菌株:细胞连结、细胞核融合、减数分裂,遗传性状分离/重新组合
方法
有性杂交
准性杂交
遗传转化
原生质体融合育种
将遗传性状不同的原生质体融合
步骤
处理去壁,获得球状原生质体
高渗溶液+聚乙二醇PEG助融
原生质体融合,基因重组
再生培养基培养
选择性培养基分离验证
进一步试验
目标菌株保藏
进一步筛选,获得高性能重组菌株
特定
杂交频率高于其他常规杂交方法
受接合型、致育型限制小
任何一株都可能成为受体,利于不同种属间的杂交
基因工程技术
基因操作、基因克隆、DNA重组
安全性评价和法规的限制
目的基因编导导入,扩增
基本操作标准
获得目的基因
生物细胞提取
纯化DNA
限制性内切酶部分酶切
反转录酶
mRNA→DNA
复杂基因
化学合成方法
简单、核苷酸序列清楚
基因库筛选、扩增
目前最有效
选择优良载体
选择优良载体分子量小,结构清楚, 具有自我复制能力的复制子
细菌/黏性/酵母菌质粒、噬菌体、动物病毒
受体细胞中大量扩增
能在体外经限制性内切酶、DNA连接酶作用,导入目的基因
选择标记
目的基因与载体的体外重组
黏端连接法——内切酶
末端连接法——T4连接酶
重组载体导入受体细胞
受体感受态
转化方法
热激法
电转
重组受体细胞的筛选和鉴定
工程菌的大规模培养
微生物的基因突变
定义
自然界分离——野生型,其碱基发生改变→稳定突变体
类型
基因突变
点突变
狭义
种类
同义突变
密码子简并性
错义突变
一个氨基酸变成另一个
无义突变
单碱基置换为终止密码子
蛋白质、酶失活
移码突变
添加
缺失
较严重
碱基置换
转换
嘧啶和嘌呤各换各的
颠换
嘧啶和嘌呤互换
引起表型突变
可观测
类型
营养缺陷
生化突变
丧失合成某种酶的能力
培养基加入相应物质
基因型命名:所需营养物的前三个字母
形态突变
细胞形态结构或菌落形态改变
噬菌体噬菌斑也会有所改变
条件致死突变
某种条件正常生长
另一种不行
抗性突变
抵抗有害理化因素
在某种抗性环境中继续生长
选择性标记
抗原突变
抗原结构发生改变
胞壁抗原
荚膜抗原
鞭毛抗原
实际是细胞成分改变
其他突变
某些能力改变
毒力
发酵能力
代谢产物
特点
自发
不对称
突变结果与引起突变的原因无关
稀有
独立
不受其他基因突变率影响
可诱变
稳定
可遗传
可逆
回复突变,性状丢失
染色体畸变
致死
类型
易位
非同源
部分染色体相连
倒位
一个染色体上某一部分旋转180°
序列反向
缺失
添加
基因突变的机制
自发突变
定义
自然状态,无人工参与
碱基的互变异构效应
碱基存在酮式-烯醇式/氨式-亚氨基式互变异构
结果
转换
碱基存在酮式-烯醇式/氨式-亚氨基式互变异构
颠换
碱基-脱氧核糖键旋转
活性氧
多因素低剂量的诱变因素
原因不详、低剂量环境和背景诱变因素长期作用
宇宙空间中的短波辐射1%
T4噬菌体热环境诱变
自身有害代谢产物的诱变效应
内源诱变剂
咖啡碱、硫氢化合物、二硫化二丙稀、重氮丝氨酸
环状突变效应(环出效应)
某一单链上出现小环
成环的碱基无法正常进行碱基配对
结果
再次复制则可发生颠换
多个碱基环出,影响氨基酸顺序
诱变
定义
物理、化学因素处理微生物,,少数个体细胞DNA分子结构改变,碱基配对发生错误,遗传性状发生突变
物理诱变剂
紫外线对DNA的损伤 及其修复
胸腺嘧啶二聚体
光复活作用
光复活酶
直接识别并结合嘧啶二聚体
独立于光
辅基作为捕光色素,光能将环丁烷C-C打开
需要光
嘧啶二聚体直接修复→光裂解酶与DNA解离
切除修复
不需要光
酶切作用→去除嘧啶二聚体
各种射线
等离子
激光
化学诱变剂
碱基类似物
5-溴尿嘧啶
碱基错配
烷基化试剂
亚硝酸胍
畸变、置换
修饰碱基→改变碱基对
脱氨基试剂
亚硝酸、硝酸
无特异性脱氨基,置换
羟胺修饰
乙基甲烷磺酸
直接修饰碱基,改变碱基配对性质
碱基对转化,置换
嵌入试剂
吖啶化合物
移码突变
与碱基分子碱基杂环相互作用,插入碱基,加长双螺旋
橙色荧光
生物诱变剂
转座子
插入基因内或基因间
基因失活/功能改变
杂交与重组
杂交包含重组
重组不仅限于杂交