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NO.2发酵工程制药
发酵工程制药，详细的总结了概述发酵工程中的微生物。发酵设备及消毒灭菌，发酵工程制药的过程与控制等等。重点内容用红色字体标记，方便小伙伴记忆~
编辑于2022-06-30 16:53:59- 发酵设备
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发酵工程制药
概述
发酵的定义
起源
发酵一词源自拉丁动词 fervere，煮沸，它描述了在酒精饮料生产过程中酵母对水果或麦芽提取物的作用的外观。
定义
对生理学家来说，发酵是指一种产生能量的过程，其中有机化合物在厌氧条件下既作为电子供体又作为电子受体，在这种过程中，能量的产生不需要氧气或其他无机电子受体的参与。
对于微生物学家来说，这个词是指通过在需氧或厌氧条件下大量培养微生物来生产产品的任何过程，以将底物转化为对人类有用的产品。
日常发酵和工业发酵的区别与联系
工业发酵与家庭面包师在面包上使用酵母时使用的过程相同，但规模要大得多
1、传统发酵
最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。
2、生化和生理学意义的发酵
指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应
如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2
3、工业上的发酵
泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程,包括
1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等
2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等
产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等
发酵的四个阶段
1.20世纪前的食品发酵
酱油、芝士、面包发酵、秸秆沤、酸菜
2.1900-1940
发酵产物是初级代谢产物，如乳酸、微生物生成的酒精、丙酮、丁醇、柠檬酸、淀粉酶
3.1940-1970
以青霉素为代表的一系列抗生素： 氨基酸、酶、有机酸、抗生素、多糖、甾体化合物
4.1975-
基因工程等高科技在发酵中的应用，胰岛素、疫苗、生长激素、细胞因子、单克隆抗体
阶段和代表性产品
发酵类型
1、微生物菌体发酵
定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。药用微生物制剂等
特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高
2、微生物酶发酵
目前的酶多数来源于微生物发酵
分类：胞内酶和胞外酶
酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺、提高产量
生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意
3、微生物代谢产物发酵
包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物
对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物
各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物
4、微生物的生物转化
定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更多经济价值的化合物
最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的
5、微生物特殊机能的利用
利用微生物消除环境污染
利用微生物发酵保持生态平衡
微生物湿法冶金
利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域
微生物发酵生产药物的分类
抗生素类
9000种
微生物发酵占70％。有价值的抗生素，几乎全部由微生物生产
抗细菌，病毒，真菌，肿瘤，原虫，寄生虫等
氨基酸类
单个氨基酸制剂
复方氨基酸制剂
微生物发酵法
酶转化法
核苷酸类
肌苷酸，肌苷，AMP，ATP，辅酶等
维生素类
维生素C的原料药2-酮基-古龙酸，维生素A的前体B-类胡萝卜素，维生素D2的前体麦角甾醇，维生素B2，B12等
甾体类激素
甾体类激素的生产过程中，一些特异反应需借助微生物的反应
治疗酶及酶抑制剂
药用酶
酶抑制剂
种类和热点
发酵工程Fermentation Engineering
定义
又称微生物工程，是一种将化学、生物化学和化学工程的基本原理科学地结合起来，利用微生物的特定性状，在生物反应器中利用现代工程技术生产工业原料、产品和服务的技术。
优缺点
优点
产品结构的复杂性和特殊性 安全过程 再生主要原料 替代原材料 反应控制 设备通用性 副产品综合利用 可以增加生产能力 可变产品类型
缺点
众多副产品， 反应慢 原料转化率低 反应浓度低 生产稳定性差 众多设备 大量浪费 容易污染 高能耗
发酵工程制药特点及发展趋势
（1）菌种是根本
（2）理论产量存在“生物学变量”
（3）常温常压下反应，安全，条件简单
（4）纯种培养，防污染
（5）可制备复杂高分子化合物
（6）分子水平，定向发酵，组合生物合成等
（7）发酵工业成本低
发酵工程中的微生物
常见的药用微生物
细菌
主要生产氨基酸，核苷酸，维生素等
细菌的形态：球形、杆形、螺旋形
细菌主要以二分裂的方式进行无性繁殖
放线菌
产抗生素最多的一类微生物；介于细菌和真菌之间
放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多
放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性孢子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体
真菌
伞菌类。属于真核生物，但不含叶绿素，无根、茎、叶，由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式繁殖。在自然界分布广泛，以寄生或腐生方式存在。
代谢产物：抗生素（青、头孢、灰黄）、维生素、酶制剂、各种有机酸、葡萄糖酸、麦角碱
直接入药：冬虫夏草、麦角、神曲、僵蚕、灵芝等
优良菌种的选育
工业化菌种的要求
1.遗传性能要相对稳定
2.生长速度快，不易感染它种微生物或噬菌体
3.目标产物产量接近理论转化值
4.目标产物分泌到胞外
5.尽可能减少类似物产量
6.能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物
优良菌种的选育方法
1、自然选育 （natural screening）
习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化
微生物不经人工处理可以发生自发突变，利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产水平菌株的过程
（1）采样
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败生物，某些水域等。
（2）分离菌株
自然选育操作步骤
2、自发突变与定向培育（directive breeding）
是指为了获得具有某些需要性状的品系，在一定的环境条件下长期处理某一微生物群体，同时不断移种，从而累积和选择合适的自发突变体的育种方法
一定情况下，长期处理微生物并移种，累积自发突变体
结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质
筛选抗性株，可成为高产株
抗性突变株的筛选
3、诱变育种（mutation breeding）
是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生存实践或科学研究用
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂
物理：紫外线，快中子
化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍，5-Br-U
4、杂交育种（hybridization breeding）
一般指利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、转化和转导等过程，促使两个具有不同遗传性状的菌株进行遗传物质交换和基因重组，以获得优良性能或新的品种的生产菌株
5、原生质体融合（protoplast fusion）
通过人工手段，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。
两个细胞融合
1.原生质体融合的一般程序
2.酶
溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶
6、基因重组（gene recombination）
将人工方法获得的一段外源DNA分子用某一限制性内切酶切割后，与载体DNA连接，然后导入到某一受体细胞中进行复制、转录和翻译，从而使受体细胞表达出外源基因所编码的遗传性状的育种技术
基因突变：自然选育、诱变育种
基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程
基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等
方法和区别
菌种保藏
在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要
分类
斜面低温法：短期保存
石蜡油封存法：中期保存
沙土管：产孢子和芽孢的
麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用
甘油悬液法：基因工程菌
冻干保藏 ：最广泛使用的方法。大部分菌种可以在冻干状态下保藏10年之久。且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输
液氮法：最为有效，保藏15年以上
宿主保存：寄生微生物的活细胞
监测微生物生长
细胞数量的测量
直接细胞计数 - 计数室
活细胞计数 - 铺板方法
细胞质量的测量
干重 - 耗时且不太敏感
浊度（吸光度或光密度） - 快速、简单、灵敏
发酵设备（重点）及消毒灭菌
发酵设备
发酵罐的基本类型
发酵罐：生物反应器
发酵工程中最重要的设备
需氧微生物反应器（通气发酵罐）
厌氧微生物反应器（嫌气发酵罐）
优良的培养装置应具有
严密的结构
良好的液体混合性能
高的传质和传热速率
灵敏的检测和控制仪表
1、搅拌釜式反应器
目前使用最广泛的发酵反应器
机械搅拌发酵罐要求
1）适宜的径高比，罐身较长，氧利用率较高
2）能耐受一定的压力
3）搅拌通风装置
4）足够的冷却面积
5）罐内要减少死角
6）搅拌器的轴封要严密，以减少泄露
罐体
培养微生物的巨大容器，密闭式的，在发酵过程中要保持一定的罐压，通常灭菌的压力约为2.5×105 Pa
形状，圆柱形，两端椭圆形, 受力均匀，减少死角，物料容易排除
高度与直径比1.7-4：1，有力空气利用率
搅拌器：
档板：克服搅拌器运转时液体产生的涡流，将径向流动改变为轴向流动，促使液体激烈翻动，增加溶氧速率
消泡器：
锯齿式、梳状式及孔板式
装于搅拌轴上，齿面略高于液面
直径罐径的0.8~0.9
罐体表面各种装置
中大型发酵罐装有供维修、清洗的入孔
罐顶装有窥镜和孔灯，在其内面装有压缩空气或蒸汽吹管
罐顶接管：进料管、补料管、排气管、接种管、压力表接管
罐身接管：冷却水进出管、空气进管、温度计管和测控仪器接口
发酵辅助设备
主要包括
无菌空气系统：过滤除菌（使用活性炭，石棉滤板，多孔合成树脂等）
灭菌系统
发酵车间的管道阀门等
要求
发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标。
发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。
在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3 。
高空取气管是远离地面几十米的管子。
地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级
因此从高空取气要比从低空取气有利得多。
油水分离器
其内部同时采用直接拦截，惯性碰撞，布朗扩散及凝聚等机理，能有效地去除空气中的水、油雾、尘埃，内部不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。
培养基和灭菌
培养基（culture medium）
1.定义：是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。
2.主要成分：碳源、氮源、无机盐、生长因子、前体
碳源：提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分，来源于糖类、油脂、有机酸、正烷烃
氮源：构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。分有机氮源和无机氮源。
（1）无机氮源：
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用
所以选择合适的无机氮源有两层意义
满足菌体生长
稳定和调节发酵过程中的pH
（2）有机氮源
来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。
成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。
如玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸；②较多的乳酸；③硫、磷、微量元素等。
3.培养基的类型
固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产
半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8% ,主要用于微生物的鉴定
液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基
合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律，培养基营养单一。如葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾。
天然培养基：采用天然动植物产品为原料，营养丰富，适合微生物的生长。如花生饼粉、蛋白胨等。
培养大肠杆菌常用两种培养基
M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4·7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10g, pH 7.0
YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，pH 7.2
发酵培养基的要求
① 培养基能够满足产物最经济的合成
② 发酵后所形成的副产物尽可能的少
③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的 供应
④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等
灭菌方法
1、空罐灭菌
高压水蒸气，消灭死角
当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌
2、实罐灭菌
效果最好，121度，30-50分钟
三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。
3、连续灭菌
营养破坏最少，128-138度，8-12分钟
发酵工程制药的过程与控制（重点）
种子的扩大培养
定义：种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子
目的
接种量的需要
菌种的驯化
缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求
生理状况稳定，个体与群体
活力强，移种至发酵后，能够迅速生长
无杂菌污染
种子制备的过程：
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
几个与种子有关的参数
发酵级数
种龄
接种量
e.g：谷氨酸生产的种子制备
斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵
方法
1、斜面
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 % ，琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次
2、 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml，32℃培养12h
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基
3、 二级种子(种子罐)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)）， 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
微生物的发酵方式
分批培养 (间歇发酵法)
先将空罐杀菌，培养基装入发酵罐，接种之后进行培养，在培养过程中，培养基成分减少，微生物增殖。微生物周围的环境随时间而变化，是一种非稳态操作法。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。
优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握。
缺点 产率低，不适于测定动力学数据。
分批培养中微生物的生长
迟滞期，菌体没有分裂只有生长
对数生长期,当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快
随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期
对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成
补料分批培养(流加法)
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。
在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。
优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。
缺点 由于没有物料取出，原料的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会。
半连续培养
补料分批培养基础上，加上间歇放掉部分发酵液进入下游提取的操作方式。某些品种采取这种方式，如四环素发酵。
优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。
缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大。
连续培养
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。
达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。
优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。通过改变稀释速率容易研究菌生长的动力学。
缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。
连续培养用于废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。
发酵过程中的中间分析项目
发酵过程的代谢参数又称状态参数，反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓
按性质分
物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等
化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等
生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等
按检测手段分
直接参数：通过仪器或其它分析手段测得的参数，如温度、pH、残糖等
间接参数：直接参数经计算得到的参数，如摄氧率、KLa等
产物产量
发酵液中发酵产物的积累，以发酵单位表示。可计算得到生产速率和比生产速率。
化学测定法：简单，但受结构类似物的影响，发酵过程中采用。
生物测定法：麻烦，人为误差大。发酵终点采用。
pH
pH与微生物的生命活动密切相关-酶催化活性
pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映-基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况。菌体生长和产物合成都需最适pH值。
糖
糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况；也反映产物合成的活力。
菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快。通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。
糖含量测定包括总糖和还原糖
总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。
还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指葡萄糖。
氨基氮
氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。
氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。
氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。
但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。
发酵后期氨基氮回升时就要放罐，否则影响提取过程。
磷含量？（书上没有）
微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根
磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施
菌体浓度和菌丝形态
菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况
菌形态用显微镜观察
菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数
发酵过程的影响因素及控制（重点）
温度的影响及其控制
1、温度影响反应速率
通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。
不同微生物的生长对温度要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0～26℃生长，嗜温菌适应于15～43℃生长，嗜热菌适应于37～65℃生长，嗜高温菌适应于65℃以上生长。
发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。
另外，温度影响发酵液的物理性质。
2、温度影响发酵方向
金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于30℃时，合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高；温度达到35℃时，几乎只产生四环素。
3、影响发酵温度变化的因素
(1)生物热
微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多
(2)搅拌热
(3)蒸发热
通气时，发酵液水分蒸发所需的热量叫蒸发热
(4)辐射热
发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射
4、温度的选择与控制
最适生长温度，最适生产（发酵）温度。
最适温度要根据菌种与发酵阶段试验决定。
温度控制：升温或冷却水。
（1）根据菌种及生长阶段选择
微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同
如黑曲霉生长温度为37℃；谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～32 ℃；青霉菌生长温度为30℃
发酵前期要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速。
中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭，有利于产物合成。
发酵后期，产物合成能力降低，提高温度，刺激产物合成到放罐。
如四环素生长阶段28 ℃ ，合成期26 ℃，后期再升温；黑曲霉生长37 ℃ ，产糖化酶32～34 ℃ 。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30～32 ℃ ，产酸34～37 ℃ 。
（2）根据培养条件选择
温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。
（3）根据菌生长情况
菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长
总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度
pH的影响及其控制
意义
pH与微生物的生命活动密切相关—— 酶催化活性
pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映——基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况
通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否
1.pH对发酵的影响
（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。
（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行 。
（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。
（4）pH影响代谢方向。pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH2~3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。
2.发酵过程pH变化的原因
1、基质代谢
（1）糖代谢
特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。
（2）氮代谢
当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升
（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降
2、 产物形成
某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。
3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。
3.最佳pH的确定和控制
配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况。
1.调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5－6.8。
2.在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。
3.通过补料调节pH。
4.当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH。
溶氧的影响及其控制
溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往最易成为控制因素。
1、溶氧的影响
28℃时，发酵液中100％的空气饱和浓度只有0.25 M左右的氧，是糖的溶解度的1/7000。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100％空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几秒（分）钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。
供氧不足，代谢异常。
2、发酵过程的溶氧变化
发酵初期，生产菌大量繁殖，需氧，溶氧下降
过了生长阶段，需氧减少，溶氧上升
发酵中后期，分批发酵的溶氧不变
生产后期，菌体衰老，溶氧上升
溶氧异常变化：染菌？
3、溶氧浓度的控制
通气，搅拌
补料
发酵过程泡沫的形成与控制
发酵过程起泡的利弊：气体分散、增加气液接触面积，但过多的泡沫是有害的
泡沫产生的原因
（1）通气搅拌的强烈程度：通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。
（2）培养基配比与原料组成：培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。
（3）菌种、种子质量和接种量：菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量。
（4）灭菌质量：培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。
起泡的危害
1.降低生产能力：在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量。
2.引起原料浪费：如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。
3.影响菌的呼吸：如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满CO2，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。
4.染菌：泡沫增多引起逃液，在排气管中粘上培养基，就会长菌。随时间延长，杂菌会长入发酵罐造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。
消泡
机械消泡
消泡剂消泡：天然油脂，聚醚类消泡剂，高碳醇，硅酮类
对发酵的影响与危害
菌体浓度的影响及控制
浓度高：产物的产量大；但营养物质消耗快→营养成分改变，有毒物质累计↑，摄氧↑，影响产物合成
浓度低：产物含量低
控制：基础培养基比例适当、中间补料
营养物质的影响及其控制
总原则：即满足菌体生长又适合产物合成
1、碳源
葡萄糖速效碳源，生长菌体
淀粉等迟效碳源，发酵次级代谢产物
一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。
2、氮源
氨基酸，玉米浆等速效氮源，生长菌体。
豆饼等迟效氮源，发酵次级代谢产物。
氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。
3、磷酸盐和微量元素
微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。
抗生素对磷酸盐浓度很敏感
生长浓度：0.32-300 M
生产浓度：1.0 M
采用生长亚适量磷酸盐浓度
4、补料
补基质和前体
中途补料，丰富培养基，避免菌体过早衰老，控制pH，改善通气等。
通常在生长旺盛期后期，发酵液泡沫位下降，这时耗氧大，溶氧水平接近临界点。
补料少量多次。
CO2的影响及控制
CO2是微生物代谢产物，溶解在发酵液中的CO2对发酵有刺激或抑制作用
CO2和H2CO3影响膜的结构
CO2使pH下降
影响菌体的呼吸速率等
CO2对产物抑制，则降低浓度；对产物促进，则增加浓度
降低通气搅拌，则增加CO2在发酵液中溶解度
染菌的防治
（1）污染噬菌体
噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较难防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产
（2）污染其它杂菌
有些杂菌使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。
有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。
放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。
青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。
疫苗生产危害很大。疫苗多采用深层培养，不加提纯而直接使用，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。
发酵前期染菌
发酵前期最易染菌，且危害最大。
原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。
在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。
染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。
发酵中期染菌
发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。
措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。
发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。
主要原因总结
1、设备渗漏：夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等
2、空气带菌
3、种子带菌
4、灭菌不彻底
发酵终点的确定
考虑生产率和成本两个方面
由实验来确证
参数
抗生素单位
过滤速度
氨基氮
菌丝形态
pH值
发酵液外观及粘度等
基因工程菌的发酵
基因工程菌及宿主系统
基因工程菌：在生物体外对DNA分子进行重组，然后克隆到适合的宿主细胞进行增殖和表达，所得到的重组体菌株即工程菌
宿主细胞-载体系统：大肠杆菌、G+细菌、酵母、哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的宿主
优点
生理学和遗传学背景清楚，有利于进行复杂的基因操作；
生长速率大，并能达到高细胞浓度（50g/l）；
能生长在简单便宜的培养基上。
缺点
蛋白表达在胞内，形成包涵体。
2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，无外膜，能将蛋白分泌到胞外。它的这一性质对生产非常有吸引力
缺点：产生大量的蛋白酶，很快降解产物。且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所以使用受限
3、酵母菌
酿酒酵母是第一个被人类利用的生物，它的最大生长速率是大肠杆菌的25%
优点：酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力
缺点：要达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等
4、哺乳动物细胞
用于重组DNA 生产蛋白的最常用宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）
优点：哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转录后处理与在整个动物中相同（某种情况下可能转录后修饰有些不同），但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外
缺点：动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低
利用基因工程菌生产的特点
基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。
基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。
现代基因工程重点用来生产蛋白质产品。
基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。 基因的不稳定性
分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失
结构不稳定性
指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变
宿主细胞调节突变
改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成
基因工程菌生产的产品
基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非蛋白质。
非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。
现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如下：
产品主要用于人类疾病的治疗，此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病人可能产生灾难性的免疫反应或副作用
有的蛋白翻译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才有活性
治疗蛋白最主要的是保证产品质量和安全，降低成本并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高
发酵工程中的代谢调控与代谢工程
微生物细胞有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节（regulation of metabolism）系统，以确保上千种酶能准确无误、有条不紊和高度协调地进行极其复杂的新陈代谢反应。
在发酵工业中，调节微生物生命活动的方法很多，包括生理水平、代谢途径水平和基因调控水平上的各种调节。
微生物代谢物：
初级代谢物，例如 干扰素
初级代谢物是在滋养期（对数期或指数期）产生的，它们要么是生长所必需的（如柠檬酸、氨基酸、维生素），要么是产生能量的代谢的副产品（如乙醇）
次级代谢物，例如 抗生素
次生代谢产物是在静止期（静止期）产生的，它们在细胞代谢中没有明显的作用。 它们中的许多都表现出抗菌特性（例如抗生素）。
次级代谢物往往是由初级代谢物的中间产物和终产物合成的！
初级代谢与次级代谢产物之间的关系
1、都受菌体代谢调节，初级代谢受菌体调控比次级代谢更严格
2、从生化代谢看，次级代谢产物的化学结构多种多样，但其生源是由少数几种初级代谢产物构成，是以初级代谢产物为母体衍生而来
3、在代谢过程中还存在许多分叉中间体，它们既可用来合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物
4、从遗传代谢看，初级代谢和次级代谢同样都受到核内DNA调控，同时相当一部分次级代谢产物的代谢还受核外遗传物质质粒的控制，因此两者在遗传代谢上既相同，又不同
生物转化Bio-transformations (bioconversions)
微生物细胞可用于催化化合物转化为结构相似但在经济上更有价值的化合物。
代谢产物合成的调控
发酵条件的控制
发酵条件不同，代谢产物也不同
1、使用诱导物
诱导酶只有在诱导剂存在时才能形成，因此在培养基中加入诱导剂，可以大量合成该类酶
最好的诱导剂不是酶的底物，而是底物的衍生物
2、控制细胞膜的渗透性
（1）通过生理学手段控制细胞膜渗透性
（2）通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性
（3）加入表面活性剂，将脂类从细胞壁中溶解： 使细胞壁疏松，通透性增加
（4）控制Mn2+ 、Zn2+的浓度： 干扰细胞膜、细胞壁的合成
3、添加前体绕过反馈控制点：
4、解除末端产物反馈调节
反馈调节的启动因素是超过菌体正常需求量的末端代谢产物。
发酵与分离过程偶联，在发酵的同时将末端代谢产物不断移走。
有膜分离、离子交换分离、萃取等。
5、培养基成分和浓度控制，解除分解代谢阻遏
葡萄糖的分解产物，阻遏次级代谢所需酶的合成，只有葡萄糖被消耗到一定浓度，分解代谢物水平降低，次级代谢物才开始大量合成。
方法：采用混合碳源培养（速效和迟效）；后期限量流加葡萄糖
各种突变株的使用
1、应用营养缺陷型菌株解除反馈调节
子主题
谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产;E：表示反馈抑制；R：表示反馈阻遏
2、抗代谢类似物突变株的使用
抗反馈调节突变株：对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性或兼而有之的菌株。
如苏氨酸发酵：组成型突变株；抗性突变株。
3、抗生素抗性突变株的应用
改变微生物代谢，使某些产物积累
定向发酵
突变生物合成
采用一些诱变剂，对药物的产生菌进行诱变，使它们丧失合成某种中间体的能力，因而不能合成原来结构的化合物，成为阻断突变株.在发酵培养这些阻断突变株时添加某种天然或者化学合成的化合物作为中间体，这些突变株能利用这些中间体合成一些新结构的最终化合物，这个过程称为突变生物合成（mutation biosynthesis）
阻断突变株的三种类型：
①营养缺陷型突变株：由于编码菌体生长必需的某种酶的基因发生突变而使菌体不能生长，导致抗生素不能合成；
②独需型突变株：菌体能正常生长，但由于编码抗生素的某一基因发生突变而丧失抗生素的合成能力；
③既是营养缺陷型又是独需型突变株：双重突变同时发生在编码菌体生长所必需的初级代谢及抗生素生物合成的次级代谢的两种基因上。
利用突变生物合成产生新抗生素
杂合生物合成（hybrid biosynthesis）
采用酶的抑制剂阻断生物合成途径中的某一步骤，抑制前体物的合成，然后再添加另外一些前体化合物，形成新的化合物。
常用浅蓝菌素抑制脂肪酸和聚烯酮生物合成途径
突变生物合成与杂合生物合成模式图
外源微生物药物的生物转化
微生物转化（Microbial transformation）是利用微生物作用来进行某种化学反应的过程，其本质是微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的过程，这一过程是由某种微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应。
几种通过不同方法制备的降血脂新药HMG-CoA还原酶抑制剂的化学结构
代谢工程
利用基因重组技术有目的对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控、生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产特定目的产物。
改变代谢途径
定义：改变分支途径流向，阻断其他产物合成，提高目标产物产量。
①加速限速反应
如：头孢霉素C的代谢工程菌的构建。青霉素N积累，克隆下一限速酶、导入、产量上升25％
②改变分支途径流向
提高目的产物支路的酶活性，占据优势、提高产量
③构建代谢旁路
将抑制物分解或转化成影响小的其他物质；如：乙酸→乙醇（乳酸）
④改变能量代谢途径
不直接作用于合成途径，而在限氧条件下提高ATP产率、碳源转化率
扩展代谢途径
引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物；
如：2-KLG（2-酮基-L-古龙酸）合成
引入外源基因后，使原来的代谢途径向前延伸，可利用新的原料合成末端产物。
如：啤酒酵母利用淀粉产乙醇
转移或构建新的代谢途径
①将多基因酶克隆到不产目的产物的菌中，使之获得产目的产物的能力。（建路）
②克隆少数基因，使原无关的两条途径联结，形成新途径，产目的产物。（连路）
③将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一菌种中，使之发生代谢转移，产目的产物。（改路）
发酵工程在制药工业上的应用
抗生素药物的生产
微生物发酵法生产的抗生素主要有
（1）β-内酰胺类抗生素：青霉素和头孢菌素
（2）四环类抗生素：四环素、土霉素、金霉素
（3）大环内酯类抗生素：红霉素、十六元大环内酯类抗生素
（4）氨基环醇类抗生素：链霉素、新霉素族抗生素、庆大霉素族抗生素、卡那霉素、妥布霉素
（5）多肽类抗生素：多粘菌素
（6）其他类抗生素：林可霉素、利福霉素、蒽环类抗生素
维生素及辅酶类药物的生产
维生素是生物体内一类数量微少、化学结构各异、具有特殊功能的小分子有机化合物，大多数需要从外界摄取
植物一般有合成维生素的能力，但微生物合成维生素的能力则随种属的不同差异较大
发酵法生产的维生素及辅酶类药物主要有：维生素B2、维生素B12、维生素C、β-胡萝卜素、麦角甾醇等
蛋白质、多肽、氨基酸和核酸类药物的生产
1、蛋白质类药物
主要：蛋白质激素、血浆蛋白质、蛋白质类细胞生长调节因子、粘蛋白、胶原蛋白、碱性蛋白、蛋白酶抑制剂和植物凝集素等。
其作用方式从生化药物对机体各系统和细胞生长的调节，扩展到被动免疫、替代疗法、抗凝血剂以及蛋白酶的抑制物等多种领域
2、多肽类药物
多肽激素、多肽类细胞生长调节因子以及含有多肽成分的其他生化药物
多肽类药物大部分是通过生化的方法从动物器官中提取制备，此外，用化学合成法和基因工程技术制备某些多肽类药物也已经获得成功
3、多肽类抗生素
由多种氨基酸经肽键缩合而成的抗生素。已有20余种用于临床。如博来霉素及其衍生物、环孢菌素A、多粘菌素
绝大多数多肽类抗生素可由细菌、放线菌产生，由真菌产生的极少
微生物生产的其它药物
核酸类药物、糖类药物（D-甘露醇、1,6-二磷酸果糖、右旋糖酐、多抗甲素、真菌多糖）、脂类药物、免疫调节剂（环孢菌素、抑氨肽酶B剂、磷酸化酶抑制剂、抑胃酶剂、亮太素、萎焉酸）、生物制品(各种疫苗、菌苗、类毒素)、酶类药物（胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、尿激酶、细胞色素c、溶菌酶、L-天冬酰胺酶等）。