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第五章：体内药物分析
人民卫生出版社《药物分析》第五章：体内药物分析，全重点整理，满满干货！适用于药学专业~小伙伴们赶快学习起来吧~
编辑于2022-07-21 10:33:32- 相似推荐
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体内药物分析
概述
药物的体内过程

药代动力学
描述药物在体内吸收、分布、代谢以及排泄的量变规律
体内药物分析的任务
对体内样品中的药物及其代谢产物或者内源性生物活性物质，进行定性、定量分析
应用于
体内药代动力学
毒代动力学
生物等效性试验
治疗药物监测
生物样品特点
体内药物组成复杂，包括原形药物、I相代谢产物及原形药物或I相代谢产物与葡萄糖醛酸形成的II相代谢产物(缀合物）、蛋白结合物等
被测药物、代谢物、缀合物的浓度低
干扰物质多，内源性物质、同时服用的其他活性物质种类繁多
采样量少，不易重新获得
样品大多需要分离和净化
体内药物分析的特点
样品需要经过分离、浓集处理
分析方法要有足够的灵敏度和选择性
样本量大，分析工作时间长，数据处理和结果阐述较为复杂
体内药物分析过程
样品制备
去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集（液液萃取、固相萃取等）
样品测定
光谱分析法、色谱分析法、免疫分析法、生物学方法
方法验证
特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度、稳定性、提取回收率等
常用体内样品的制备与贮藏
体内样品的种类、采集与制备
血样
分类
血浆
概述
选用最多。因血浆中的药浓可反映药物在体内的状况，且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴
血浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取的上清液，量约为全血的一半
取血量不超过动物总血量15%~20%
血浆的制备
采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以2500~3000r/min离心5~10 min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆
抗凝剂
最常用的是肝素（heparin），肝素是体内正常成分，因此不会改变血样的化学组成或引起药物的变化，一般不会干扰药物的测定。通常1ml血液需用肝素0.1~0.2mg或20IU(1mg~126IU)。可不必准确控制
其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等，是与血液中的钙离子结合的试剂，它们可能引起被测组分发生变化或干扰某些药物的测定，不常使用
血清
血清的制备
采集的静脉血液置试管中，于37℃或室温放置30min~1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在2500~3000 r/min离心5~10min，上层淡黄色液体即为血清
现文献所指血药浓度为血浆或血清中药物总浓度( 游离的和血浆蛋白结合的总浓度）
血浆与血清的区别
血清比血浆只是少一种纤维蛋白原
一般血浆中药物浓度与血清中药物浓度相当
血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%~60%（血清为全血的40%左右），多数用血浆进行分析
若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品
尿样
尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式排出
尿样常需加入防腐剂
尿药浓度变化较大，一般以某一时间段或单位时间内尿中药物的总量表示
成人一日排尿量为1~5L。尿样包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量）
尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血药浓度相关性较差，且尿液量较大不易保存等
唾液
唾液中的药物浓度通常与血浆浓度相关。样品易得，取样无损害，尤易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推定血浆中游离药物浓度
唾液由腮腺、颌下腺和舌下腺三个主要的唾液腺分泌汇集而成前两者分泌量占总量90%。两者中药物浓度大致相当
取样
在潄口后15min，安静状态下采集口腔内然流出的唾液；也可在刺激下快速采样（需注意干扰），如口嚼石腊片或将柠檬酸、维生素C等置于舌尖，弃去初始部分后采集
VC作为强还原剂，影响体内肝药酶活性，干扰药物代谢，不适合长期大量使用
采集的唾液离心取上清供测定
组织
反映药物在脏器组织中的分布情况，常用胃、肝、肾、肺、心等
制备
测定之前一般需制成匀浆
组织样品的处理
沉淀蛋白法、酸水解法、酶水解法 （蛋白水解酶）
头发
应用
体内微量元素含量测定
用药史的估计
临床用药和药物非法滥用的区别
毒性药物检测
样品的采集
采集枕部发样（带根部）
微量元素在前额部位的头发中含量最低，枕部含量最高
样品的洗涤
除去外源性污染物，推荐使用丙酮-水-丙酮；丙酮浸泡搅拌10min，自来水漂洗3次，再用丙酮浸泡搅拌，自来水、蒸馏水各洗3次
样品的处理
直接甲醇提取、氧瓶燃烧、酸水解、碱水解、酶水解（葡萄糖醛酸酶）
体内样品的贮存与处理
冷藏与冷冻
取来的生物样品24h内不能完成测定，需要进行冷藏或冷冻
血浆和血清需采集后及时分离，一般最迟不超过2h，分离后再置冰箱或冷冻柜中保存（-20~-80℃）
尿样应立即测定，若收集24h的尿液不能立即测定时，可加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐剂，一般可保存24~36h，也可加入叠氮化钠较长时间保存
唾液在保存过程中会放出二氧化碳使pH值升高。另唾液中含有粘蛋白，须离心后冷藏或冷冻
去活性
终止酶活方法
快速冷冻、微波照射、加入酶活性阻断剂、调节pH、样品煮沸等
体内样品处理
体内样品预处理的目的
使待测药物游离
将药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的总浓度
满足测定方法的要求
介质复杂，干扰物多，待测物浓度低，须分离干扰物质、富集待测药毒物
改善分析环境
为了防止分析仪器的污染、劣化，提高检测灵敏度和选择性
样品预处理方法的选择
分析方法与样品处理步骤的选择
常用体内样品处理方法
要考虑：药物的理化性质（极性、酸碱性、光谱特性、挥发性、稳定性），药物测定的目的，选用的生物体液和组织的类型，待测物的浓度范围，样品制备与分析技术的关系
蛋白沉淀法 (protein precipitation PP)
概述
测定血样或者组织匀浆样品时，去除蛋白质，使结合的药物释放出来，测定药物总浓度
分类
有机溶剂沉淀法
甲醇、乙腈
注意事项
含药血浆与有机溶剂体积比为1:2~1:3（稀释程度）
离心力12000~15000g，时间10min
低温离心最佳
中性盐析法
强酸沉淀法
三氯醋酸、高氯酸
热凝固法
蛋白沉淀法特点
操作简单，应用较广
样品被稀释，待测药物浓度降低
仍有其他干扰成分
常用沉淀剂及用量
溶剂沉淀法加入2~3倍沉淀剂，强酸沉淀法加入0.6~1倍沉淀剂沉淀效果好
分离与浓集
概述
当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需分离、纯化与浓集
将待测药物从体内样品中分离纯化出来，并进行富集处理
分类
液-液萃取法
溶剂选择
合适的溶剂是成功的主要条件 
了解药物与溶剂的化学结构及其性质：相似相溶
对药物未电离分子可溶，对电离形式分子不溶
沸点低、易挥发，毒性小与水不相混溶
不影响紫外检测
具有较高的化学稳定性和惰性
不易乳化
溶剂用量
一般有机相与水相之比为1：1~5：1
溶液的pH调节
最佳pH选择主要与药物的pKa值有关。酸性药物pH应低于药物pKa值1~2个单位；碱性药物pH应高于药物pKa值1~2个单位
生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易被萃取出来
例
空白血清在pH2、pH7和pH13三种缓冲液中用乙醚提取，提取液HPLC(220nm)测定，在pH13下提取液中杂质峰最少

提取操作
进行一次（至多二次）提取
提取后用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）进行浓集
液液萃取特点
优点
可将大部分内源性杂质去除
经济实用
可使样品富集
可一次进行多个样品萃取
缺点
乳化
乳化的去除
加少量固体氯化钠到水相中可减轻乳化
轻微乳化离心
严重乳化低温冰箱快速冷冻破坏乳化层后融化离心
污染环境
固相萃取法
适用于所有类型的化合物，对于极性药物、非极性药物和完全解离的酸碱药物，都可以使用固相萃取
概述
以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作，故有时这种方法又称为固相提取
活化→上样→淋洗→洗脱→洗脱液浓集
固相萃取的模式
反相固相萃取
填料为C8、C18
正相固相萃取
填料为硅胶
离子交换固相萃取
阴离子交换
阳离子交换
实验步骤
用甲醇润湿小柱，活化填料
用水或适当的缓冲液冲洗小柱，除去大部分甲醇
加样，使样品经过小柱，弃去废液
血浆样品、尿样可直接上柱，样品量0.1~2ml，流速1~2ml/min
用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质
选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析
基本操作流程
特点
少溶剂、少污染、减少液液萃取的乳化
适合各种液体检材如血、尿、洗胃液、现场水、饮料等，对于肝、肾、胃以及其他固体检材，均需制成水液方可进行固相萃取
固相萃取特别适用于极性较大、水溶性较大、稳定性较差、不宜用过强的酸碱处理的药物
自动化固相萃取：柱切换高效液相色谱法
将固相萃取和高效液相色谱在线连接
柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术
用两个或两个以上柱子连接构成色谱系统，使不同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是柱切换技术
基本原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱上完成色谱分析
超滤法
膜分离技术，可用于测定生物样品中游离药物浓度
按照分子截留量的大小，可分离30~1000kD的可溶性生物大分子物质。可加压过滤或高速离心
超滤法特点
不引入有机溶剂、破坏小
游离药物分析的首选方法
离心速度不能太低，以防游离药物分离不完全；也不能太高，以防破坏蛋白-药物结合体
只有游离药物才能透过半透膜到达下方EP管中
辍合物的水解
酸水解法
强酸、加热
酶解
常用葡萄糖醛酸酶，一般控制pH4.5~5.5 ， 37℃孵育数小时
溶剂解
化学衍生化
目的
使药物变成能被分析的性质
提高检测灵敏度
增强药物稳定性
提高对光学异构体分离的能力
直接用高效液相分离困难，需要化学衍生化
衍生化方法
柱前衍生
衍生后再进入色谱分离
柱后衍生
色谱柱分离后，经衍生再进入检测器检测，常引起峰展宽
气相色谱衍生化方法
硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化
液相色谱衍生化方法
紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性衍生化
体内样品分析方法与方法验证
分析方法的建立
分析方法的选择
概述
生物样品中药物浓度μg~ng级，干扰大；要求方法专属性强，灵敏度高
常用分析方法
色谱分析法，包括色质联用
免疫分析法
生物学方法
常用分析方法比较
分析方法建立的一般程序
色谱条件的筛选
确定最佳分析检测条件；色谱柱(型号、牌号、填料性质、柱长度)；流动相组分及配比、流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等；使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)；良好的色谱参数(n、R、T)和适当的保留时间(tR)
色谱条件的优化
在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下
空白溶剂试验
溶剂（方法特异性）
空白生物基质试验
内源性物质干扰（方法特异性）
模拟生物样品试验
方法验证（效能指标）
色谱条件的确定
试验样品的测试
考察代谢物的干扰，进一步评价方法的专属性
分析方法的验证
体内样品分析方法验证的分类
完整验证
分析方法验证的主要目的是证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证
包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（ 标准曲线性能） 、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性等
部分验证
概述
在对已被验证的分析方法进行小幅改变情况下， 根据改变的实质内容， 可能需要部分方法验证
可能的改变包括：生物分析方法转移到另一个实验室，改变仪器、校正浓度范围、样品体积，其他基质或物种，改变抗凝剂、样品处理步骤、储存条件等
应报告所有的改变， 并对重新验证或部分验证的范围说明理由
分类
分析方法在实验室间转移
仪器型号、生物样品预处理方法等操作均未改变时，验证重现性
改变生物介质
相同物种、相同介质不同抗凝剂，验证方法的特异性和稳定性
方法应用于复方给药
应再验证方法的特异性
生物样品有限如小儿用药或稀少生物介质
亦可部分验证
交叉验证
应用不同方法从一项或多项试验获得数据， 或者应用同一方法从不同试验地点获得数据， 需要互相比较这些数据时，需要进行分析方法的交叉验证
尽可能在试验样品被分析之前进行交叉验证， 同一系列质控样品或试验样品应被两种分析方法测定
体内外药物分析方法验证的比较
体内药物分析方法验证的内容
选择性
方法的选择性（selectivity）又称特异性（specificity），用来证明使用该方法所测定的物质是预期的待测物（原形药物、特定的活性代谢产物或内标），体内样品所含的内源性物质和相应代谢产物、降解产物及其他共同使用的药物不得干扰对样品的测定或干扰在分析方法的可接受范围内
考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点
内源性物质的干扰比较
待测药物或其活性代谢产物检测信号
代谢产物的干扰比较
模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号
伍用药物的干扰
还要考虑患者可能同时服用药物（通常为数有限）的干扰
提供多张色谱图：空白生物样品图、空白加对照、实际生物样品图
与参比方法的相关性
对于色谱法至少要考察6个来自不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图反映分析方法的特异性
当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%，并低于内标响应的5%时，通常即可以接受
残留
应该在方法建立中考察残留并使之最小
通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%
为确保残留不影响准确度和精密度。可以在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品
标准曲线与线性范围
标准曲线（standard curve）
要求
应该使用至少6个校正浓度水平，不包括空白样品（不含分析物和内标的处理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质），测定药物浓度与响应的相关性
除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式，最小二乘法或加权最小二乘法回归。优选加权最小二乘法，可使截距较小，对低浓度样品更准确
建立的一般步骤
采用校正标样，即模拟生物样品（与待测的含药生物样品相同的生物基质+标准物质）建立
为避免有机溶剂体积对测定的影响，可采用
标准溶液体积的加入量不超过空白基质的5%
工作溶液挥干后加入空白生物基质涡旋混匀
绘制
以待测药物的检测响应（外标法）或与内标物质的检测响应的比值（内标法），用因变量y对模拟血药浓度自变量x求得回归方程（y＝a＋bx）及其相关系数
r≥0.99（色谱法）或≥0.98（生物学方法）
要求最低浓度点的偏差在±20%以内、其余各浓度点的偏差在±15%以内
线性范围
标准曲线的最高与最低浓度的区间，应能覆盖全部生物样品的药物浓度（不包括零点），不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度
定量上限高于峰浓度，定量下限低于峰浓度的1/10~1/20
定量下限
定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。定量下限是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的
一般要求
信噪比应大于5
应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度
准确度在80%～120%
RSD＜20%
准确度与精密度
准确度
概述
指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度。因实际生物样品的浓度是未知的，所以通常使用模拟生物样品测定
应采用加入已知量分析物的样品（非校正标样，而是质控样品即QC样品）通过重复测定已知浓度的待测物样品获得准确度
测定方法
取高（上限75%左右）、中、低（定量下限的3倍以内）、定量限4个浓度，每一浓度至少5个样本，与随行的标准曲线同法测定、计算方法回收率
限度要求
方法回收率应在85%～115% （LOQ附近80%～120%）
相对标准偏差RSD在±15% （LOQ附近为±20%）以内
方法精密度(precision)
概述
精密度是描述分析物重复测定的接近程度，定义为测量值的相对标准差（变异系数）。应使用与证明准确度相同分析批样品的结果，获得在同一批内和不同批间定量下限以及低、中、高浓度质控样品的精密度
测定方法
照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 、定量限4个浓度的QC样品，并分析测定。每一浓度5～6个样品，每个样品测定1次
实验包括批内精密度及批间精密度。批间精密度通过至少3个分析批，且至少分两天进行
限度要求
对于质控样品，批内及批间变异系数一般均不得超过15% ，定量下限的变异系数均不得超过20%
稀释可靠性
样品稀释不应影响准确度和精密度。应该通过向基质中加入分析物至高于定量上限浓度，并用空白基质稀释该样品（每个稀释因子至少5个测定值），来证明稀释的可靠性
准确度和精密度应在15%之内，稀释的可靠性应该覆盖试验样品所用的稀释倍数
基质效应
当采用质谱方法时，应该考察基质效应
使用至少6批来自不同供体的空白基质，不应使用合并的基质。对于每批基质，通过计算基质存在下的峰面积（空白基质提取后加入分析物和内标），与不含基质的相应峰面积（分析物和内标的纯溶液）比值，计算每一分析物和内标的基质因子
相对基质因子
分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子
从6批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数不得大于15% 。测定应分别在低浓度和高浓度下进行
样品稳定性
分析物和内标的储备液（浓溶液）和工作溶液的稳定性
从冰箱储存条件到室温或样品处理温度，基质中分析物的冷冻和融化稳定性（三次冻融试验）
基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性
处理过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳定性
处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性
提取回收率
概述
提取回收率与方法回收率的意义不同
方法回收率代表方法的准确度，也称相对回收率
提取回收率考察生物样品预处理过程造成的药物的损失程度，也称绝对回收率
体内样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现，而非提取的是否完全，即对提取回收率没有具体限度的要求，只要提取出的药物满足方法灵敏度的要求即可
测定方法
取空白生物基质（如血浆），照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的QC样品（每一浓度至少5个样品），每个样品分析测定1次
另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定
AT：经萃取后的QC样品的检测信号
AS：未经萃取的标准溶液的检测信号
作为外源性药物使用的内源性物质的测定
对生物介质进行处理，活性炭吸附或透析去除所含药物
使用不含内源性物质的生物介质
使用替代介质
采用标准加入法
具体测定的处理
试验样品分析
概述
方法考察完毕后作实际生物样品的测定，需要在试验样品分析开始前证实生物分析方法的效能。应根据已验证的分析方法处理试验样品以及质控样品和校正标样，以保证分析批被接受
分析批
一个分析批包括空白样品和零浓度样品， 包括至少6个浓度水平的校正标样，至少3个浓度水平质控样品，以及被分析的试验样品
一个分析批所有样品（校正标样、质控和试验样品）应在同一时间处理，由同一分析者相继处理，使用相同的试剂，保持一致的条件
质控样品应该分散到整个批中，以保证整个分析批的准确度和精密度
对于生物等效性试验，建议一名受试者的全部样品在同一分析批中分析，以减少结果的变异
分析批的接受标准
校正标样测定回算浓度一般应在标示值的±15%范围内，定量下限应在±20%范围内。不少于6个校正标样，至少75%标样应符合这些标准。如果校正标样中有一个不符合标准，则应拒绝这个标样，重新计算不含该标样的标准曲线，并进行回归分析
质控样品的准确度值应在标示值的±15%范围内。至少67%质控样品，且每一浓度水平至少50%样品应符合这一标准
在不满足这些标准的情况下，应该拒绝该分析批，相应的试验样品应该重新提取和分析
试验样品的重新分析
由于校正标样和/或QC样品的准确度和精密度不符合接受标准，导致一个分析批被拒绝
试样样品中内标的响应与校正标样和QC样品的内标响应差异显著
进样不当或仪器功能异常，色谱峰不佳
测得的浓度高于ULOQ或低于LLOQ，且该批的最低浓度标样从校正曲线中被拒绝
已测样品再分析
当存在蛋白结合以及已知和未知代谢物的回复转化、样品均一性或同服药物引起的差异，可能影响样品在处理和储存过程中分析物的准确度和精密度时需要进行样品再分析
推荐通过在一定时间周期内重新分析试验样品，来评价实际样品测定的准确度。推荐选择最大浓度样品和消除相样品（所含代谢物较多）
推荐从几名受试者处获得样品进行再分析，接近预期的最大浓度及消除相浓度。样品不应合并
试验样品浓度超出定量范围的处理
浓度高于标准曲线上限
分取部分样品用相应的空白生物介质稀释至方法可测浓度范围后重新测定
浓度低于定量限
可增加未知样品的体积，但应在相同的条件下制备QC样品，验证方法的特异性、准确度、精密度；或者降低方法的定量限
在药代测定时可不必处理，达峰前以0计，达峰后以无法定量（not detectable）计算，以减少0值对AUC计算的影响
典型体内药物分析应用
LC-MS/MS测定人血浆中氨氯地平对映体及其药物动力学应用
液液提取后液质联用测定
替诺福韦双特戊酯的体内药动学及其对左卡尼汀血药浓度的影响
蛋白沉淀后液质联用测定