蛋白质的结构和功能

生物化学与分子生物学：生物大分子的结构与功能——蛋白质的结构与功能 导图包括概述、组成、分子结构、结构与功能的关系、理化性质、蛋白质的分离纯化、蛋白质的分类这些方面的知识点。

蛋白质

• 概述
  • 蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。 Proteins are macromolecules composed of amino acids linked together through peptide bonds. （一、什么是蛋白质）
  • 二、生物学重要性
    • 1. 蛋白质是生物体重要组成成分
      • 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质； 细胞的各个部分都含有蛋白质。
      • 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％， 某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。
    • 2. 蛋白质具有重要的生物学功能
      • 1）作为生物催化剂（酶，代谢调节）
      • 2）免疫保护作用
      • 3）物质的转运和存储
      • 4）运动与支持作用
      • 5）参与细胞间信息传递
    • 3. 氧化供能
      • 成人所需能量约18%来自蛋白质的分解代谢
• 组成
  • 元素组成
    • 主要元素
      • C (50~55%), H (6~7%), O (19~24%), N (13~19%), S (0~4%)
    • 少量元素
      • P, Fe, Cu, Zn, I, …
    • 元素组成特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％； 即1g蛋白质氮相当于6.25g蛋白质。1/16%=6.25
      • 100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100
  • 基本组成单位 ——氨基酸
    • 概述
      • 自然界中300余种； 组成人体蛋白质的氨基酸主要有20种，且均属 L-α-氨基酸（甘氨酸除外）。
        • 甘氨酸R基为H，无手性碳，属对称型，无D-L构型
      • 各种氨基酸的差异体现在侧链R基团上
        • • • 镜像（Fisher投影式）
    • 分类
      • • 非极性疏水性氨基酸
        • 极性中性氨基酸
        • 芳香族氨基酸
          • 侧链含芳香基团的氨基酸
        • 酸性氨基酸
          • 侧链含负性解离基团的氨基酸
        • 碱性氨基酸
          • 侧链含正性解离基团的氨基酸
      • • 必需氨基酸：人体必不可少，而机体内又不能合成、必须从食物中补充的氨基酸
          • 共有8种：Lys（赖）、Trp（色）、Phe（苯丙）、Met（甲硫）、 Thr（苏）、Ile（异亮）、Leu（亮）、Val（缬）。 甲 携（缬）来（赖）一（异）本（苯）亮 色 书（苏）
        • 半必需氨基酸：人体虽能够合成His（组），但合成的量通常不能满足正常的需要
    • 理化性质
      • 两性解离及等电点
        • 氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。
        • 等电点(isoelectric point, pI)
          • 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等， 成为兼性离子，所带净电荷为零，呈电中性。 此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。
      • 紫外吸收 （含共轭双键的芳香族氨基酸）
        • 色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近
          • 大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以 测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。
      • 茚三酮反应 （生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰570nm）
  • 肽（peptide）
    • 肽（peptide）是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。
      • 氨基酸通过肽键形成的蛋白质或活性肽
    • 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而形成的化学键。
    • 几个概念
      • 肽链两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……
      • 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽（oligopeptide）
      • 由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽（polypeptide）
      • 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而分子不全，被称为氨基酸残基（residue）
      • 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。
        • 多肽链有两端
          • N 末端：多肽链中有自由氨基的一端
          • C 末端：多肽链中有自由羧基的一端
    • 几种生物活性肽
      • 谷胱甘肽(glutathione, GSH) ——是机体内重要的还原剂
      • 多肽类激素及神经肽
        • 体内许多激素属寡肽或多肽
          • 催产素（九肽）、加压素（九肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、 促甲状腺激素释放激素（三肽）等
        • 神经肽(neuropeptide)
          • 一类在神经传导过程中起信号转导作用的肽类，称为神经肽。 脑啡肽（5肽）、β-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等
• 分子结构
  • • 一级结构(Primary structure)
      • 定义
        • 蛋白质的一级结构指多肽链从N端到C端的氨基酸排列顺序， 包括氨基酸种类、数目、排列顺序及二硫键的位置。
          • Definition: The sequence of amino acids in the polypeptide chain.
      • 主要化学键
        • 肽键，有些蛋白质还包括二硫键
      • 意义
        • 每种蛋白质都有其各自的一级结构!
        • 蛋白质分子的一级结构是形成空间结构的基础
        • 蛋白质的生物学功能是由蛋白质分子特定的天然空间构象所决定的
        • 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。 ▲Anfinsen原理(Anfinsen principle)：蛋白质的功能与其高级结构密切相关， 而高级结构由一级结构所决定。但一级结构不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。（Nobel Prize in Chemistry 1972)
  • 高级结构 -空间结构）
    • 二级结构(Secondary structure)
      • 定义
        • 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构， 即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置(并不涉及氨基酸残基侧链的构象) 。
          • Definition: The local conformation of the backbone (or main chain) of a polypeptide chain.
      • 主要化学键
        • 氢键
      • 肽单元 (peptide unit)
        • 定义
          • 参与肽键的4个原子C、O、N、H，及相邻的2个α-C原子Cα1、Cα2位于同一平面，Cα1和Cα2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了 所谓的肽单元 (peptide unit)
            • 多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以α碳原子相隔。
            • 而Cα-C键和Cα-N键是单键，可以自由旋转， 其中Cα-C键旋转的角度称ψ，Cα-N键旋转的角度称φ。
            • ψ和φ这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对
        • 意义
          • 肽单元平面是构成主链构象的基本单位。
          • 以肽单元平面为基本单位的旋转就是肽链折叠、盘旋的基础。
      • 主要形式
        • α-螺旋（α-helix）
          • 常见的蛋白质二级结构
          • 要点
            • 多肽链的主链围绕中心轴上升，呈有规律的右手螺旋
            • 螺旋3.6氨基酸/圈、螺距0.54nm,由氢键稳定螺旋
            • 肽链中每个肽键N-H都与其上第四个肽键的C=O形成氢键，基本与中轴平行。 为一种稳定、致密的二级结构
          • 举例
            • α-角蛋白：构成哺乳动物毛发的蛋白质
        • β-片层 (β-pleated sheet )
          • β-折叠使多肽链形成片层结构
          • 要点
            • 肽单元依次折叠而成锯齿状结构一般较短，只含5-8个氨基酸残基
            • 两条或两条以上的肽段平行或反向平行排列，依次折叠成锯齿状
            • 肽链间形成氢键，与折叠长轴基本垂直，稳固β-片层
            • 是肽链较为延展和松弛的结构
          • 举例
            • 丝蛋白： β-角蛋白以β-折叠为主
        • β-转角（β-turn）
          • 在蛋白质分子中普遍存在
            • 通常发生在多肽链180°回折时的转角上
        • 无规卷曲（random coil）
          • 在蛋白质分子中普遍存在
            • 不规则的二级结构
      • 氨基酸残基侧链对二级结构形成的影响
        • 蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。
        • 一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成α-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构
      • 超二级结构
        • 在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段， 在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，被称为超二级结构
        • 常见的组合形式有：αα，βαβ，ββ， β-折叠筒等
      • 模体（motif）是具有特殊功能的超二级结构
        • 二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近， 形成一个特殊的空间构象，发挥特殊功能，称为模体(motif)
        • 是具有特殊功能的超二级结构
        • 常见形式
          • α-螺旋-β转角（或环）-α-螺旋 模体
          • 链-β转角-链 模体
          • 链-β转角-α-螺旋-β转角-链 模体
          • 例如
            • 钙结合蛋白中结合钙离子的模体
              • 锌离子可稳定α-螺旋 常见于DNA、RNA结合蛋白
    • 三级结构(Tertiary structure)
      • 定义
        • 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。 即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。
          • Definition: Tertiary structure formed by all amino acid residues of the entire polypeptide chain.
      • 主要化学键
        • 非共价键（次级键）
          • 疏水作用、盐键、氢键和范德华氏力等（次级键）
      • 要点
        • 8个α-螺旋区；
        • 氨基酸亲水的基团倾向于分布在分子的表面，疏水的基团在分子的内部；
        • 非共价（次级键）相互作用。
      • 结构域（domain）：三级结构层次上的独立功能区
        • 大分子蛋白质的三级结构常可被分割折叠成多个 较为紧密且稳定的区域，并各行使其功能，称为结构域(domain) 。
      • 分子伴侣（chaperon）
        • 参与蛋白质折叠
        • 分子伴侣（chaperon）为一类特殊的蛋白质，通过提供一个保护环境 从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。
        • 作用
          • 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开， 如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。
          • 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。
          • 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。
        • 热休克蛋白 Heat shock protein，Hsp 家族
      • 特点
        • 一条完整的多肽链所有原子/基团的三维空间排布， 包括所有的主链骨架和侧链基团的相对位置。
        • 三级结构的作用力主要是次级键（主要是疏水作用，也有盐键、氢键和范德华力）。
        • 完整肽链的三级结构中常存在结构和功能相对独立的结构域。
    • 四级结构(Quaternary structure)
      • 定义
        • 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用， 称为蛋白质的四级结构。
      • 主要化学键
        • 次级键
          • 亚基之间的结合主要是疏水作用、氢键和盐键等次级键
          • 意义：亚基间聚合与解聚互为可逆，是调节蛋白质功能活性的一种方式。
      • 亚基（subunit）的概念
        • 体内许多蛋白质含有2条或2条以上独立的肽链，每条肽链都有其完整的三级结构， 称为亚基（subunit）。
        • 构成四级结构的亚基可以相同,也可以不同。
      • 特点
        • 亚基聚合成四级结构的作用力主要是次级键 （盐键和氢键，也有疏水作用和范德华力）。
        • 构成四级结构的亚基可以相同也可以不同。
        • 亚基间的聚合较疏松，聚合与解聚互为可逆，这是调节蛋白质功能活性的重要方式。
  • 小结
• 结构与功能的关系 （论述题）
  • 一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础 ●一级结构是空间构象的基础 ●一级结构相似的蛋白质空间构象及功能也相似 ●一级结构的序列提供重要的生物进化信息 ●一级结构中关键氨基酸残基的改变会影响蛋白质的功能
    • （一）一级结构是空间构象的基础
      • 牛核糖核酸酶的一级结构
    • （二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能
      • 意义：一级结构的相似性可提示蛋白质的同源性，用以预测未知蛋白质的功能。
      • 胰岛素
    • 反之：一级结构改变，功能也有相应改变
      • 氨基酸组成变化改变其功能
      • 加压素 催产素
    • （三）氨基酸序列提供重要的生物进化信息
      • 细胞色素C的进化树
        • 在各种细胞色素C中几乎只有28个位置上的氨基酸残基是完全不变的。
        • 不同种属的细胞色素C的氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关， 亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多。
        • 细胞色素C中氨基酸变异情况与生物进化的分类基本平行， 故可据此描绘出生物进化的系统树。
    • （四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病
      • 例证：镰刀形红细胞贫血
        • 血红蛋白的酸性氨基酸(谷)变成非极性疏水性氨基酸(缬)
      • 结论：一级结构中关键氨基酸残基(即使一个氨基酸残基)的改变会影响蛋白质的功能
      • • （参与功能活性部位的残基或特定构象关键部位的残基具有重要的作用， 即使整个分子中只发生一个残基的异常，该蛋白质的功能也会受到明显的影响）
      • “分子病”：由蛋白质分子发生变异所导致的疾病。
  • 二、蛋白质的功能依赖特定空间结构 （二、蛋白质的空间结构是其功能活性的基础） 1.蛋白质结构相似，其功能相同。 2.蛋白质结构改变，功能发生变化。变构效应； 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后， 能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 3.若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变， 仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。
    • （一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似功能相同
      • 肌红蛋白（myoglobin，Mb）
        • 肌红蛋白存在于几乎所有哺乳动物中，主要位于肌肉组织中，主要功能为储存氧。
      • 血红蛋白（hemoglobin，Hb）
        • 血红蛋白为4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。
        • Hb亚基之间有8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。
    • （二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合
      • Hb与Mb一样能可逆地与O2结合。 Mb/Hb与O2结合后称为氧合Mb/Hb，氧合Mb/Hb占总Mb/Hb的百分数 （称氧饱和度）随O2浓度变化而改变。
        • • 肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）的氧解离曲线
          • 提示一：Hb与Mb的生理功能不同 Mb为存氧蛋白，在低氧状态下（组织中）储存氧气； Hb为运氧蛋白，在低氧状态下（组织中）释放氧气， 在高氧状态下（肺中）储存氧气。
          • 提示二：Hb的生理功能由4亚基的协同效应来完成： Hb的4个亚基与4个氧分子结合时平衡常数不同； 第一个与氧结合的亚基平衡常数最小； 最后一个与氧结合的亚基平衡常数最大； 说明，每一个亚基在结合氧后会促进之后的亚基对氧的结合。
      • 协同效应（cooperativity）
        • 寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后， 能影响此寡聚体中另一个亚基与配体的结合能力，此现象称为协同效应。
          • 如果是促进作用则称为正协同效应 （positive cooperativity）
          • 如果是抑制作用则称为负协同效应 （negative cooperativity）
        • 血红蛋白各亚基间产生正协同效应的机制
          • 血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中， 继而引起肽链位置的变动。
            • O2与铁红素的结合致F段的微小移动
            • 血红蛋白亚基间及亚基内的盐键 （Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。）
          • 序变模型
          • 齐变模型
        • • 胎儿如何高效获取氧？
            • HbF(α2γ2)与O2的亲和力明显高于HbA , 这显然有利于它们从母体胎盘(氧分压大大低于肺)中获取 之所以HbF与亲和力高于HbA , 是因为与α亚基结合的γ亚基不能结合2,3-BPG。
      • 变构效应
        • 变构效应亦称别构效应， 是指蛋白质亚基与配基（体）的结合导致蛋白质空间结构的改变并伴随功能变化的效应，称为变构效应。
        • ●具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白(allosteric protein)
        • ● 能引起蛋白质发生别构效应的物质称为别构剂或别构效应剂（allosteric effector)
        • ● 别构效应充分说明了蛋白质空间结构与功能之间的关系。
      • 小结
        • Mb与Hb的功能相似吗？仅具三级结构的Mb与多亚基的Hb功能又有什么区别呢？
        • Mb与Hb都具有可逆性结合O2的能力；
        • 单肽链结构的Mb更易与O2结合，对O2有更高的亲和力，是一个存氧蛋白质；
        • 4亚基结构的Hb通过单亚基内部的变构效应，促发多亚基间的协同作用， 使Hb在不同条件下对O2有不同的亲和力，从而行使着运输O2的功能。
    • （三）蛋白质构象改变可引起疾病
      • 疯牛病 牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalopathy, BSE) 变异型克雅氏病( variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD)
      • 蛋白质构象疾病
        • 蛋白质构象疾病： 若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变， 但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。
        • 致病机理： 有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀， 产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。
        • 人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病、疯牛病等。
• 理化性质
  • 两性电离及等电点
    • 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外， 氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
    • 等电点（isoelectric point，pI）
      • 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等， 即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
  • 蛋白质具有胶体性质
    • 蛋白质属于生物大分子，分子量可达1万至100万 kD 之巨， 其分子直径可达1～100nm，为胶体范围之内。
    • 胶体稳定的因素：
      • • 表面电荷
        • 水化膜
    • 应用
      • 点豆腐：蛋白质（胶体）颗粒的沉淀。
  • 蛋白质空间结构破坏而引起变性
    • 蛋白质的变性（denaturation）
      • 在某些物理和化学因素作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏， 也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。
      • 本质：破坏非共价键（次级键）和二硫键，不改变蛋白质的一级结构
      • 造成因素：加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。
      • 应用
        • 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。
        • 此外，防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。
    • 变性与复性（renaturation）
      • 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后， 蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性（renaturation）
    • 变性与沉淀
      • 在一定条件下，蛋白质水溶性下降，从溶液中析出。
      • 变性的蛋白质易于沉淀；有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。
    • 蛋白质的凝固作用（protein coagulation）
      • 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块难溶于强酸和强碱。
    • 变性、沉淀、凝固
      • 蛋白质变性时会发生沉淀。 ×
      • 沉淀蛋白质不一定变性。 √
      • 沉淀的蛋白质不一定凝固。 √
      • 凝固的蛋白质可以复性。×
  • 紫外吸收——蛋白定量
    • 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。
  • 呈色反应——蛋白定量
    • 茚三酮反应（ninhydrin reaction）
      • 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。
    • 双缩脲反应（biuret reaction）
      • 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应。双缩脲反应可用来检测蛋白质的水解程度，也用于蛋白质的定量测定。
• 蛋白质的分离纯化
  • 意义
    • 1.研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性
    • 2.提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态
    • 3.作为药物：要求纯度高
    • 4.作为食品添加剂：纯度要求一般
  • 方法 分离纯化蛋白质常用技术的原理： 一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物 ——蛋白质的大分子性质 二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法 ——蛋白质的胶体性质 三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离 ——蛋白质的两性解离 四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离 ——蛋白质的的两性解离和抗原性质 五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离 ——蛋白质的大分子性质
    • 一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物
      • 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
      • 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜， 达到浓缩蛋白质溶液的目的。
    • 二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法
      • 使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。
      • 盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液， 使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。
      • 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。 利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质， 可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。
    • 三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离
      • 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis)
        • 据支撑物的不同，分
          • 薄膜电泳
          • 凝胶电泳
      • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。
    • 四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离
      • 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时， 根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等， 使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配， 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。
      • 蛋白质分离常用的层析方法:
        • 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。
        • 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。
    • 五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离
      • 超速离心法(ultracentrifugation) 既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
• 蛋白质的分类（自学）
  • 根据蛋白质组成成分:
    • 单纯蛋白质
    • 结合蛋白质= 蛋白质部分 + 非蛋白质部分
  • 根据蛋白质形状
    • 纤维状蛋白质
    • 球状蛋白质
  • 根据蛋白质的功能