第二章 临床生物化学检测方法的选择与评价

临床生物化学检测方法的选择：包含临床生物化学检测方法的分级，准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法等等

临床生物化学检测方法的选择

• 临床生物化学检测方法的分级
  • 决定性方法/一级参考方法
    • 准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法
    • 仅有少数应用
    • 用于发展及评价参考方法，与一级参考物质相互验证
  • 参考方法/二级参考方法
    • 准确度与精密度已经充分证实、干扰因素少、系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计、有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析测量范围的分析方法
    • 可追溯到决定性方法，大多数应用
    • 用于评价常规方法的性能与试剂盒的质量，以及鉴定二级参考物质和为质控血清定值
  • 常规方法
    • 指性能符合临床或其他目的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析测量范围，而且经济实用的方法
    • 供临床常规检验使用，可以不是唯一的
    • 可经组织认可后称为推荐方法或候选参考方法，应具有足够的实验证据
• 临床生物化学检测方法的选择
  • 确定检测需求
    • 临床需求
    • 方法学的分析性能要求
    • 自动分析仪的性能要求
  • 选择和建立候选方法
    • 根据方法性能选择
    • 根据所需条件设备选择
  • 设定质量目标
  • 方法学评价
  • 方法的实施
  • 临床样本点常规检测
  • 质量控制及结果报告

2.临床生物化学检测方法的评价和性能判断

• 方法学评价
  • 是通过实验途径，测定并评价方法的性能，尤其是方法的精密度与正确度（在试验中实际测定的是不精密度与偏倚）
  • 强调的是误差，评价实验的过程就是对误差的的测定
• 检测系统的比对
  • 检测系统
    • 完成一个项目检验所涉及的样本、仪器、试剂、校准品、质控品、操作程序、质量控制、保养计划和操作者等的组合
    • 配套检测系统
      • 整个检测系统所涉及的各个部分由同一厂商或仪器的指定厂商提供并配套使用
      • 结果具有溯源性，需进行性能验证（精密度、正确度与分析测量范围）
    • 自建检测系统
      • 实验室根据自己意愿自行建立的检测系统
      • 无溯源性，性能确定
  • 检测系统比对的实施步骤
    • 制订分析质量目标
    • 评价仪器性能
    • 确定对比检测系统
    • 评价检测系统的分析性能性能
    • 比对
• 方法学性能评价
  • 精密度评价（EP5-A2）和方法对比评价（EP9-A2）
  • 精密度与精密度评价
    • 概念
      • 精密度
        • 是指在规定条件下获得的相互独立的测量结果之间的一一致程度
        • 常以不精密度来度量；仅与随机误差相关
      • 重复性
        • 是指在相同测量条件下，对同一被测量物进行连续多次测量所得结果之间的一致程度，对应批内不精密度
      • 复现性
        • 是指改变测量条件后，同一被测量物的测量结果之间的一致程度
    • 精密度评价
      • 标本种类
      • 标本浓度
      • 标本数量
      • 标本复溶
      • 实验周期
      • 质量控制
      • 离群值剔除
      • 实验方案
    • 结果判断
      • 与厂家声明的不精密度指标比较
      • 与卫生行业标准比较
      • 与CLIA’88的允许总误差（TAa）比较
      • 实验室自定标准
      • 方法决定图
    • 精密度图
      • 精密度往往取决于分析物的浓度，以分析为浓度为横坐标，以SD或CV为纵坐标绘制的一条函数关系曲线
  • 正确度和准确度评价
    • 概念
      • 正确度
        • 由大量（或无限次）测量结果得到的平均值与真值之间的一致程度
        • 反映系统误差
      • 偏倚
        • 指大量（或无限次）测量结果的平均值与真值之间的差异
        • 临床样本的“真值”很难获得，常用“可接受参考值”代替
          • 基于科学原理的理论值或确定值
          • 基于一些国家或国际组织的实验工作的指定值或认证值
          • 基于科学或工程组织赞助下合作试验工作中的约定值或认证值
          • 上述均不能获得，就使用规定测量总体的均值（期望值）
      • 回收实验
        • 将样本分装，其中一份样本加入已知量的待测物，另一份样本加入等体积溶剂，同时测定，计算测定结果与“理论值”的差值，计算回收率
      • 准确度
        • 指单次测量结果与真值的接近程度
    • 正确度评价/方法比较试验
      • 比较方法的选择
      • 患者标本量和浓度范围
      • 单次或双份重复测量
      • 实验周期
      • 标本稳定性
      • 质量控制
      • 正确度判断
  • 检测限与分析灵敏度评价
    • 概念
      • 检测限
        • 空白限（LoB）
          • 指测量空白样本时能观察到的最高测量结果
        • 检出限（LoD）/检测低限/最小检出浓度
          • 指在给定的显著性水平内，可以定性地从样本中检出分析物的最低浓度
        • 定量限（LoQ）
          • 指满足声明的精密度和（或）正确度，在规定的实验条件下能够可靠定量的分析物的最低浓度
        • ①多数情况下LoB<LoD，LoD≤LoQ；②检测结果≤LoB，结果应报告“未检出”或“浓度<LoD”；③LoB<检测结果≤LoD或LoD<检测结果<LoQ，结果应报告“检出，浓度<LoQ”,即样本中含有分析物，但不能提供可靠的定量结果；④检测结果≥LoQ,可直接报告检测结果
      • 分析灵敏度和功能灵敏度
        • 分析灵敏度
          • 以横坐标为浓度，纵坐标为测量信号的校准曲线的斜率
          • 反映检测系统或方法辨别微小分析物浓度差异的能力；斜率越大、方法精密度越高、分析灵敏度越高
        • 功能灵敏度
          • 测定结果变异系数符合特定要求时的分析物浓度，可用LoQ取代
    • 检测线评价
    • 注意事项
  • 分析测量范围和线性评价
    • 概念
      • 分析测量范围/测量区间/可报告范围
        • 在不进行任何稀释、浓缩或其他预处理等情况下，测量程序直接测量样本，测量结果不精密度和偏倚在允许范围内的分析物的浓度（或活性）范围
      • 临床可报告范围
        • 样本经过稀释、浓缩或其他预处理，以扩展直接分析测量下的分析物浓度（或活性）范围
      • 线性
        • 在分析测量范围内，测量值与预期的分析物浓度（或活性）在数学上有明确的直线关系
      • 线性范围
        • 测量值与预期的分析物浓度（或活性）成直线关系的范围
    • 线性评价
      • 实验标本
      • 标本数量
      • 标本测定
      • 数据收集与统计处理
    • 注意事项
  • 分析特异性与干扰评价
    • 概念
      • 分析特异性
        • 检测系统或方法不受样本基质中存在的潜在干扰物或干扰因素（如脂血、溶血、胆红素、抗体、分析物的代谢物或降解产物、抗凝剂、防腐剂等）的影响，测定目标分析物浓度的能力
      • 干扰
        • 因标本特性或其他成分影响，分析物浓度出现有临床意义的偏差
    • 干扰评价方法及原理
      • 配对差异实验
      • 剂量效应实验
      • 利用该患者标本进行偏倚分析
    • 注意事项
    • 干扰处理
      • 干扰物对检测结果的影响可通过一些方法进行补偿或修正，以尽量减少干扰对特定患者群体的影响
      • 若怀疑干扰物引起严重偏差，可采取措施
        • 收集资料，调查是否存在干扰
        • 告知医生干扰可能导致不可靠的结果
        • 尽可能使用分析特异性高的方法
• 质量目标设定与方法学性能判断
  • 基本概念
    • 误差
      • 测量结果对于真值（或可接受参考值）的偏离
    • 总误差（TE）
      • 定义：随机误差与系统误差的总和
      • 公式：TE=B+Z*CV
        • B-偏倚
        • CV-变异系数
        • Z-与置信水平相关，常选用1.65（90%置信水平）或1.96（95%置信水平）
    • 质量目标/质量规范/质量标准/分析目标/分析性能目标
      • 定义
        • 能帮助临床医学决策所要求的质量水平
      • 目标
        • 允许不精密度
        • 允许偏倚
        • 允许总误差（TEa）
          • 最为重要，代表从临床使用角度所能接受的分析误差大小
  • 质量目标设定
    • 质量目标设定方式
      • 评估分析性能对具体医学决定的影响
      • 评估分析性能对一般医学决定的影响
      • 专业建议或指南提出的分析质量目标
      • 国家法规或室间质量评价计划组织提出的分析质量目标
      • 根据当前技术水平设定分析质量目标
    • 基于生物学变异的质量目标设定
      • 优点
        • 考虑检验项目在疾病监测和疾病诊断两大方面的临床使用与医学需求
        • 有可利用的生物学变异数据库
        • 计算模型简便易懂
        • 与实验室大小或规模无关，适用于大多数检验项目和所有实验室
      • 三种方法
        • 允许不精密度的设定
          • 如用于疾病监测，检验结果的总变异包括了分析前变异、分析变异（CVA)、和个体内生物学变异（CVI）,忽略分析前变异，检测结果的总变异为(CVA^2+CVI^2)^1/2
            • 分析变异CVA<0.5CVI,检测结果总变异的增加不超过12%
              • 适当性能目标0.5CVI
            • 分析变异CVA<0.25CVI,检测结果总变异的增加不超过3%
              • 最佳性能目标0.25CVI
            • 分析变异CVA<0.75CVI,检测结果总变异的增加不超过25%
              • 最低性能目标0.75CVI
        • 允许偏倚的设定
          • 如用于疾病监测，需要将检验结果与参考区间进行比较。忽略分析变异，参考区间的变异由生物学变异（CVI、CVG）决定，即人群生物学变异（CVI^2+CVG^2）^1/2,CVG——个体间生物学变异
            • 分析偏倚（BA）<1/4人群生物学变异，超出参考区间人群增加不超过16%
              • 适当为0.25（CVI^2+CVG^2）^1/2
            • 分析偏倚（BA）<1/8人群生物学变异，超出参考区间人群增加不超过2%
              • 最佳为0.125（CVI^2+CVG^2）^1/2
            • 分析偏倚（BA）<3/8人群生物学变异，超出参考区间人群增加不超过34%
              • 最低为0.375（CVI^2+CVG^2）^1/2
        • 允许总误差的设定
          • 0.75CVI+1.65*0.375*（CVI^2+CVG^2）^1/2
          • 0.5CVI+1.65*0.25*（CVI^2+CVG^2）^1/2
          • 0.25CVI+1.65*0.125*（CVI^2+CVG^2）^1/2
• 最普遍接受

校准与溯源性

• 基本概念
  • 校准
    • 规定条件下，为确定测量仪器或测量系统所指示的量值或实物量具（包括参考物质等）所代表的值，与对应的由标准所复现的量值之间关系的一组操作
  • 临床检验中的校准
    • 在规定条件下，通过测定已知浓度或活性的分析物（即校准品或标准物），建立试剂或仪器系统与分析物浓度或活性之间关系的过程
  • 溯源性
    • 测量结果与标准量值的属性，是测量结果或标准量值通过一条不间断的校准链与给定的参考标准相联系
      • 溯源链（上述“不间断的校准链”）
        • 在临床检验中指计量学级别由低到高的、交替出现的测量程序和标准物，溯源链中的每一步比较都有给定的不确定度
      • “给定的参考标准”
        • 是国家标准和国际标准，可理解为参考物质或参考测量程序。测量结果与参考标准的联系可以是直接的，也可以通过中间测量程序和校准物间接进行，即溯源链可长可短
    • 类型
      • 溯源至SI单位
      • 不能溯源至SI单位
• 参考测量程序
  • 参考测量程序/参考系统
    • 是实现溯源性的基础
    • 组成
      • 参考物质
        • 是一类充分均匀，并具有一个或多个确定的特性值的材料或物质，用以校准测量系统、评价测量程序或为材料赋值
        • 分类
          • 根据其具有校准和评价测量系统的两个主要功能
          • 校准物
            • 实在校准函数中其值被用作自变量的参考物质，用以校准测量系统或为材料赋值
          • 正确度质控物
            • 用于评价测量系统的测量偏倚的参考物质
        • 分级
          • 一级参考物质
            • 具有最高及计量学特性的参考物质，具有最小测量不确定度
          • 二级参考物质
            • 由一种或多种二级参考测量程序定值，一把具有与实际样品相等或相似的基质，主要用于量值传递
          • 三级参考物质
            • 指附有证书的参考物质，其一种或多种特征值由建立了溯源性的程序确定，使之可溯源到准确复现的表示该特征值的计量单位
      • 参考测量程序
      • 参考测量实验室
• 溯源链的结构与工作原理
  • ISO/DIS17511溯源链
    • 3个层次
      • 国际计量局、国际计量机构或经认可的参考实验室
        • SI单位→一级参考测量程序→一级参考物质→二级参考测量程序→二级参考物质
      • 制造商
        • →厂家首选测量程序→厂家工作校准品→厂家常备测量程序→厂家产品校准品
      • 临床实验室
        • →临床实验室常规测量方法→常规标本→结果
    • 工作原理
      • 一级参考测量程序为一级参考物质定值并给出相应的不确定度
      • （一个或多个）一级参考物质校准二级参考测量程序
      • （一个或多个）二级参考测量程序为二级参考物质定值并给出测量不确定度
      • （一个或多个）二级参考物质校准厂家首选测量程序，或厂家首选测量程序本身就是二级参考测量程序，由一级参考物质校准
      • 厂家首选测量程序为厂家工作校准品定值并估计其不确定度
      • 由厂家的一个或多个工作校准品或计量学上高一级的校准品来校准厂家常备测量程序。厂家的常备测量程序接近常规测量方法，但测量不确定度较小
      • 厂家常备测量程序或任何计量学上更高一级的测量程序为厂家的产品校准品赋值
      • 厂家的产品校准品用于校准终末用户（临床实验室）的常规测量方法常规测量方法用于临床常规样本检测溯源链结构
  • 国家标准与技术研究所（NIST）溯源链
    • 3个层次
      • 各国的国家计量研究所建立的决定性方法
      • 参考实验室发展的参考方法
      • 临床试验时使用的常规方法
• 参考物质的互换性和基质效应
  • 参考物质的互换性/互通性/替代性
    • 是参考物质的重要属性。用常规方法和参考方法测量参考物质所得结果的数字关系，与上述方法测量实际临床样本所得结果的数字关系的一致程度。参考物质的互换性直接影响量值传递的正确性
  • 参考物质缺乏互换性的原因
    • 分析物
      • 制备参考物质时使用动物来源的样本或加外源性分析物，可因分析物的存在形式不同导致参考物质缺少互换性。如观察到互换性随着分析物浓度増大而变差，考虑互换性缺乏由分析物引起
    • 基质效应
      • 指被测量以外的某种样品特性对测量及被测量的值的影响。
      • 包括
        • 分析干扰：影响量本身不产生测量信号，但它增大或减小被测量的测量值
        • 测量过程的非特异性：影响量本身产生测量信号
      • 产生于
        • 参考物质的加工方法
        • 参考方法与常规方法的检测原理不同
  • 参考物质互换性问题的处理
    • 选择基质与实际样品尽量接近的参考物
    • 选择分析特异性较好、对基质不过分敏感的常规测量方法
    • 进行量值溯源的确认，以判断参考物质的互换性是否影响量值传递的正确性
    • 参考物质的互换性不可接受时，需进行修正或选择其他参考物质

测量不确定度

• 参考文件
  • EP29-A
  • ISO15189要求
    • 临床实验室应为检验过程中用于报告患者样品被测量值的每个测量程序确定测量不确定度，实验室在解释测量结果时应考虑不确定度
• 基本概念
  • 测量不确定度
    • 根据所用到的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数。
  • 标准不确定度分量
    • 测量结果的不确定度往往有多个来源，对每个不确定度来源评定的标准差
    • 评定分类
      • A类评定
        • 对在规定测量条件下测得的量值用统计分析的方法进行的测量不确定度分量的评定，其结果可以用标准差表征
        • 该类评定需要在规定条件下进行多次重复性或复现性试验，从而得到一组或多组观测列并对观测列进行统计分析，其结果较客观、可信
      • B类评定
        • 并非由统计方法评定，而是根据经验或其他信息假设的概率分布估算的标准不确定度分量，也可用标准差表征
        • 该类评定需要有可靠的数据来源，或有充分的经验、专业知识以及理论分析能力，方法简单，但主观性、经验性较强
  • 合成标准不确定度
    • 当测量结果是由若干个输入量求得时，测量结果的标准不确定度由各输入量的标准不确定度用方差和或协方差方法合并得到
  • 扩展不确定度/总不确定度
    • 是确定测量结果区间的量，合理赋予被测量值在一定概率下包含于此区间
    • 是合成标准不确定度与一个大于1点数字因子的乘积，该因子称为包含因子( k )取值与扩展不确定度的置信水平有关， k -2（约95%), k =3（约99%)
• 内容
  • 测量不确定度对测量结果可信性、有效性的怀疑程度或不肯定程度，是定量说明测量结果的质量的一个参数。说明被测量之值分散性的参数，它不说明测量结果是否接近真值
  • 测量不确定度与溯源关系密切，溯源链的每一步都有给定的不确定度，溯源性的建立必然伴随不确定度评定
  • 测量不确定度是经典误差理论的产物
  • 误差与测量不确定度的区别
    • 误差是一个单个数值，可用于修正结果；测量不确定度以区间形式表示，不可用于修正结果，且测量不确定度大小与测量值高低有关
    • 误差可以忽略，不确定度永远存在
• 评定方法
  • “自下而上”评点方法
    • 概念
      • 全面地研究可能影响测量不确定度的因素，并将这些影响分量进行定量，转变为标准不确定度再进行合成
    • 步骤
      • 规定被测量，说明测量要求，包括被测量以及被测量所依赖的输入量的关系，建立测量模型
      • 识别不确定度的来源，列出完整清单，确定不确定度分量的合成方式
      • 对各种来源的不确定度进行评定，以标准差表示
      • 计算合成标准不确定度和扩展不确定度
    • 优点
      • 能够全面了解影响检测质量的潜在因素，发现重要的测量不确定度来源并进行干预和控制，得到准确、可靠的检验结果，在改进实验室检测技术及检测质量方面具有不可替代的优势
    • 问题
      • 临床实验室分析前因素常常复杂而难以估计，评定过程繁琐，工作量大，对实验室条件和技术人员要求高。不同实验室对上述不确定度分量的识别与评定结果很难一致，使实验室间缺少可比性，影响临床医生对检验结果测量不确定度的正确理解和使用
    • 补充
      • 可进行 A 类评定或 B 类评定，其中 B 类评定的有关资料可从文献、设备仪器资料等获得
      • 该法评定不确定度较精确，是 GUM 所描述的评定方法，参考实验室常用该方法评定不确定度
      • 充分考虑临床实验室检验结果的各种不确定度来源
        • 分析前因素
        • 分析中因素
        • 分析后因素
  • “自上而下”评定方法
    • 概念
      • 指根据统计学原理，直接评估某一测量系统总的不确定度。评定数据可来自于实验数据、质量控制数据、标准物质的相关数据等。该评定方法简便，更适合在常规实验室应用
    • 步骤
      • 确定被测量
      • 评估实验室内测量复现性引入的标准不确定度
      • 评估偏移引入的标准不确定度
      • 计算合成标准不确定度及扩展不确定度
    • 优点
      • 无需了解测量过程中的每个不确定度来源，经济、实用、可行性好
    • 问题
      • 强调分析测量过程本身的测量不确定度，未充分考虑分析前和分析后因素对检测结果测量不确定度的影响。
    • 补充
      • 如果对“自上而下”方法评定的测量不确定度有质疑时应考虑用“自下而
      • 主要从实验室内复现性和偏移两方面评定不确定度
        • 数据来源
          • 质控数据
          • 特定方案试验数据
          • 方法学验证试验数据
  • 常规实验室不确定度评定的基本方法
    • 识别主要的不确定度分量：常规实验室评定不确定度常用自上而下的评定方法
    • 根据 PT / EQA 数据评定不确定度
      • 计算偏移
      • 计算偏移的不确定度
      • 计算合成不确定度
    • 与有证参考物质（ CRM )比较评定不确定度
    • 与 RMP 结果比较评定不确定度