导图社区炎症相关的硝酸盐促进口腔V. parvula在肠道内异位定植

炎症相关的硝酸盐促进口腔V. parvula在肠道内异位定植

炎症相关的硝酸盐促进口腔V. parvula在肠道内异位定植，包括：口腔厌氧菌韦荣球菌属物种在炎症性肠病患者肠道中丰度升高、韦荣球菌能利用炎症标志性代谢产物硝酸盐，依赖narGHJI操纵子的硝酸盐呼吸依赖narGHJI操纵子的硝酸盐呼吸，可促进韦荣球菌属在有机酸中的生长、硝酸盐呼吸可促进韦荣球菌属利用氨基酸和肽作为碳源，这种代谢转变伴随着碳代谢的变化、硝酸盐呼吸可促进韦荣球菌属利用氨基酸和肽作为碳源，这种代谢转变伴随着ATP合成途径的变化。

编辑于2022-10-16 23:37:45 湖北省

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炎症相关的硝酸盐促进口腔V. parvula在肠道内异位定植

口腔厌氧菌韦荣球菌属物种在炎症性肠病患者肠道中丰度升高

临床研究数据

临床研究队列的纵向研究肠道微生物组数据

UC患者粪钙卫蛋白(FC)增加，V. parvula丰度随之增加

CD VS non-IBD，结果同上

韦荣球菌能利用炎症标志性代谢产物硝酸盐，依赖narGHJI操纵子的硝酸盐呼吸

V. parvula培养基类型

无

V. parvula不能生长

+lactate or malate

增加外源性碳源

V. parvula可生长

SKN

+nitrate

没有外源性碳源

V. parvula可生长

+lactate or malate

外源性碳源+硝酸盐

V. parvula生长最好

narG::tet

=+SK

没有外源性碳源，但有硝酸盐

V. parvula不可生长

+lactate or malate

外源性碳源+硝酸盐

V. parvula生长不好

推测原因：NarHJI基因失活，导致呼吸硝酸盐还原酶失活

V. parvula实验细菌类型

narG::tet

为了确认narGHJI基因簇参与硝酸盐利用，我们生成了一个敲除narG::tet，导致narHJI基因失活

在硝酸盐的作用下，诱导narGHJI操纵子的转录

SKL

narG、narR无升高

SKN

narG、narR明显升高

SKLN

narG、narR无升高

基因水平验证

依赖narGHJI操纵子的硝酸盐呼吸，可促进韦荣球菌属在有机酸中的生长

硝酸盐呼吸使V在SKN上生长

对碳源的分析表明，酵母提取物是生长所必需的

当酵母提取物存在时，没有酪胨会大大降低V生长

我们假设V能够利用氨基酸和/或多肽作为碳源（有机碳源）

评估各种碳源的贡献

在硝酸盐呼吸过程中，由于补充了各种蛋白质水解物，引起V菌生长随氨基酸/多肽剂量依赖性

用液相色谱-质谱分析SK培养基氨基酸或多肽在生长过程中是否被消耗

注意到在不同生长阶段氨基酸的数量显著减少

天冬氨酸在指数中期消耗，而谷氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺只有在指数后期缺乏乳酸(首选碳源)时才消耗殆尽。

在硝酸盐呼吸过程中，单独使用天冬氨酸和天冬酰胺能够提高V菌的生物量和生长速度

尽管在缺乏硝酸盐的情况下，天冬氨酸在出现明显的滞后期后也促进V菌生长(图2 d)

许多二肽在指数期后期被消耗

V菌的生长随GlyAsp的增加而增加

删除质子依赖的Opt家族肽转运体(optA::chl optB::tet双突变体)，但不删除atp依赖的Opp寡肽转运体，消除了这种效应(图2f在10h时)

利用跨膜的质子电化学势梯度将氨基酸或寡肽逆浓度梯度进行跨膜转运的膜蛋白。

硝酸盐呼吸过程中，V菌可能利用跨膜质子电化学势能利用氨基酸作为碳源。

硝酸盐呼吸可促进韦荣球菌属利用氨基酸和肽作为碳源，这种代谢转变伴随着碳代谢的变化；

研究硝酸盐呼吸过程中氨基酸/多肽的代谢物，主要代谢产物:丙酸盐和乙酸盐

无论碳源（乳酸）存在与否，在硝酸盐呼吸过程中丙酸盐浓度都很低

乙酸盐是通过丙酮酸的氧化和脱羧产生的，可以形成ATP，但效率降低。在发酵和有乳酸存在的硝酸盐呼吸过程中，乙酸盐浓度升高

在氨基酸/多肽生长过程中，与乳酸生长过程相比，乙酸盐的产生减少，这不仅反映了更多的糖异生代谢，而且减少了通过丙酮酸产生的ATP

代谢产物(丙酸盐+乙酸盐)的形成减少，提示相对多的碳可能可用于糖异生代谢

不同的生长条件下有不同基因的表达

比较代表口腔和炎症肠道环境下的乳酸发酵(SKL)和硝酸盐呼吸(SKLN)细胞生长的表达谱变化

硝酸盐呼吸导致硝酸盐还原酶簇的上调，以及有氧呼吸过程中生产的丙酸生成减少。

比较硝酸盐呼吸细胞利用氨基酸/多肽(SKN)或乳酸(SKLN)生长的转录组基因的不同

参与嘌呤、氨基酸和多肽(optB)利用或运输的基因被上调

硝酸盐呼吸可促进韦荣球菌属利用氨基酸和肽作为碳源，这种代谢转变伴随着ATP合成途径的变化；

生物系统中，蛋白质、脂肪和糖等能量物质在氧化阶段释放的能量以高能电子形式由NAD和FAD从底物中移出，这些电子由NADH和FADH2携带，借助内膜上呼吸链的电子传递能量给O2。电子在传递过程中能量放出，被用于质子H跨膜泵送，即将质子从线粒体基质逆浓度地跨膜运到膜间腔，从而在内膜两侧产生了一个电化学的H梯度。

评估各种生长条件下质子动力(PMF)和ATP合成途径的作用

为了研究PMF，我们使用了DiOC2(3,3 ' -二乙基氧甲碳菁)染料，该染料随电化学梯度的变化被输送到细胞中，从而反映膜电位的变化。

无论碳源是什么，硝酸盐的存在导致WT细胞的膜电位显著增加，这与NarGHI复合体功能有关

2,4-二硝基苯酚使氧化磷酸化解偶联化，消耗大量ATP，可以消除膜电位梯度

乳酸发酵过程中，2,4-DNP处理降低了生物能和生长速率

硝酸盐存在的情况下，添加2,4-DNP到乳酸和氨基酸/多肽中，降低了细菌的生物能和生长速率

表明更高的膜电位促进细菌的生长，是以牺牲碳源为代价的

质子动力势，是电化学H+梯度，电子传递和质子泵送相偶联的结果。

损耗质子梯度降低细菌的生长，意味着PMF对于细菌通过质子依赖转运体的底物运输或通过OP合成ATP至关重要

为了研究PMF的作用，我们首先评估了乳酸和天冬氨酸的运输

在没有硝酸盐处理的静止细胞，乳酸和天冬氨酸几乎没有消耗；生长中的细胞消耗乳酸，硝酸盐进一步刺激乳酸的消耗

在narG::tet细胞中，硝酸盐添加刺激乳酸消耗的差异消失了，表明这种增强依赖于硝酸盐呼吸(图4d)。然而，还不确定为什么缺乏硝酸盐的narG::tet细胞比WT细胞更快地消耗乳酸。生长中的细胞消耗了少量的天冬氨酸，但添加硝酸盐没有影响(图4c)。

因此，硝酸盐呼吸作用通过促进以PMF依赖方式促进营养物质的吸收，直接促进V的生长。

然后用一个缺乏ATP合酶的菌株(ATP::tet)来评估PMF在ATP合成中的重要性

缺乏ATP合酶的细胞在发酵过程中无法与乳酸一起生长，但在硝酸盐呼吸过程中生长几乎与WT一样好

硝酸盐允许atp::tet生长，但不能通过OP产生ATP，这意味着，对于乳酸，ATP的产生主要是通过底物水平磷酸化(SLP)。因此，必须利用硝酸盐产生的PMF以促进底物的摄取。

为了进一步了解在发酵和呼吸过程中PMF的作用以及SLP和OP对ATP合成的贡献，我们检测WT和ATP::tet细胞中的ATP水平。

乳酸的添加增加了WT细胞的ATP水平，但对atp::tet细胞无影响。补充乳酸和硝酸盐显著提高了WT和atp::tet细胞中的ATP水平，进一步证实当存在乳酸时，ATP主要是通过SLP产生的

这也表明，在乳酸发酵过程中，可能需要ATP合酶的逆反应来生成PMF并激活质子依赖性的乳酸摄取(图5a)。补充硝酸盐后，atp::tet细胞产生的ATP大约是WT细胞产生的atp的一半(图5c在20和40分钟时)。因此，当V菌利用氨基酸/多肽生长时，ATP合成需要OP。当细胞与氨基酸/多肽一起生长时，这与atp操纵子的更强的诱导一致(图3f,g)。

结肠炎模型小鼠中，小韦荣球菌的narG缺失突变菌株丰度显著低于野生型菌株，说明硝酸盐呼吸是结肠炎中小韦荣球菌异位定植的基础

评估了这种代谢对V菌定植炎症肠道的重要性

在限菌小鼠模型（ASF）中研究了肠上皮损伤和结肠炎是否会导致V菌的扩增

3%硫酸葡聚糖钠(DSS)或对照溶液预先定植特定共生菌群组合小鼠8 d，第4天灌胃WT或narG::tet

炎症细胞因子增加和体重和结肠长度的减少

通过qPCR检测粪便中V菌丰度的急剧增加

narG::tet菌株会扩增，但其丰度明显低于WT。narG基因上调

竞争实验：在ASF小鼠在相同的剂量和时间点接受1:1的WT(chl)和narG::tet菌株作为单定植实验

通过qPCR检测，WT(chl)在炎症肠道中的定植水平明显高于narG::tet(抗体)

与对照组相比，DSS处理的ASF小鼠的粪便和结肠组织中WT-V菌菌落形成单位明显增多（分别多出10倍和100倍）

这表明炎症促进了V菌的移植或为扩张提供了更多机会。

V菌是否可以在正常肠道细菌小鼠上定植

DSS处理的小鼠再次显示体重和结肠长度减少

WT V菌在肠内的扩张能力增强，并超过了narG::tet

硝酸盐在V菌增殖中的作用，我们比较了V菌在WT和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)敲除(KO) SPF小鼠中的定植

iNOS缺陷小鼠粪便中的V菌丰度显著降低

表明V菌利用宿主细胞中iNOS活性产生的炎症相关的硝酸盐异位定植肠道