分子水平上的同源重组

这是一篇关于分子水平上的同源重组的思维导图，包括同源重组的模式、同源重组中的蛋白质机制、同源重组机制的遗传结果、交配型的转换、真核细胞的同源重组、DNA断裂频发并启动同源重组等内容。

分子水平上的同源重组

• 二、同源重组的模式
  • Holliday模型
    • 步骤过程
      • ①联会的同源双链DNA。其中一条链断裂；（至少有100个碱基对完全相同或接近相同才发生联会） ②断裂的DNA形成单链区； ③单链区入侵双链DNA，并与同源DNA双链互补配对，形成holliday联结体； 断裂的5’端链则于同源DNA的另一条链配对； ④通过分支移位交换DNA序列，形成异源双螺旋DNA； ⑤Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。
    • 产物
      • a.通过拆分切开的链共价连接，重组体的异源双链区两侧来自不同的亲本DNA，实现基因重排，故被称为交换产物。（剪切产物/拼接重组体） b.通过拆分切开的链共价连接，重组体的两端来自同一条亲本DNA，只是中间含有一段异源双链区。因此，重组并未产生两侧基因重排，产物叫补丁产物。（非交换产物/片段重组体）
  • 双键断裂修复模型
    • 步骤过程
      • ①重组起始于一条DNA双链的断裂； ②双链断裂后，DNA裂解酶逐步降解其中一条断裂的DNA分子，产生带有3’末端的单链DNA区；(有酶参与处理形成单链区) ③3’端单链入侵另一个双链DNA分子寻找互补序列配对； ④入侵链的3’末端作为合成新DNA的引物，以互补链为模板开始延伸，从而重新合成断裂处被破坏的DNA片段； ⑤单链入侵与互补链形成holiday联结体，并随新链的延伸移位，形成两个holiday联结体
  • 两种模型的比较
    • 同
      • ①都有双链断裂，同源DNA排列并引入切口； ②两个重组DNA分子间产生碱基互补区并形成Holliday 联结体； ③分支移动； ④拆分，可产生两种产物。
    • 异
      • Holliday模型：1.涉及到一个DNA分子单链缺口；2.不涉及DNA的合成，无DNA聚合酶作用；3.形成一个Holliday联结体。 双键断裂修复模型：1.DNA分子发生了双键断裂；2.链延伸后有DNA聚合酶的作用；3.形成两个Holliday联结体。
• 三、同源重组中的蛋白质机制
  • RecBCD蛋白
    • 结构和功能
      • RecBCD是由3个亚基所组成复合体，呈三角形轮廓，具有多种酶活性（外切酶和解旋酶活性）RecB：3’→5’解旋酶/核酸酶； RecD：5’→3’解旋酶；RecC：将进入亚基的DNA切割，将两条DNA链引入B和D，识别Chi位点；
    • 步骤
      • ①RecBCD酶结合于断裂的DNA分子，以>1000 bp/s的速度移动，不断解旋和降解，产生单链DNA； ②RecBCD酶的活性受控于具有特殊序列的Chi位点（GCTGGTGG）； ③遇到Chi位点之前， 两条链的解旋速度RecD> RecB， 导致RecB 结合链(3’端)DNA在复合物前面形成环状； ④遇到Chi位点后，暂停移行，发生三种改变：a. 3’端环形DNA被拉近RecB； b. RecBCD复合物的构象发生改变，RecD亚基解偶联；c. RecBCD复合物的核酸酶活性发生改变，不再以3’→5’方向剪切DNA，相反，5’→3’ 方向剪切加快，形成3’单链DNA，适于RecA单链结合蛋白的组装。
    • Chi位点控制RceBCD
      • Chi位点发生重组率高10倍; Chi位点有极性，离Chi位点越近，重组频率越高； Chi位点有方向性，只允许RecBCD按Chi方向移动； Chi位点控制RecBCD核酸酶活性，可防止外来DNA的侵入； Chi位点序列由8个核苷酸组成（GCTGGTGG）； 大肠杆菌染色体序列中约共有1009个chi位点，容易被RecBCD加工产生3’单链DNA，进而引发重组。
  • RecA蛋白(链交换蛋白)
    • 结构
      • RecA蛋白丝非常大，通常包括约100个RecA亚基和300个核苷酸的DNA； RecA蛋白丝可以容纳多条DNA链，在重组中间体中以1条和3条DNA的RecA蛋白丝更为常见； 与RecA蛋白结合的DNA，其相邻碱基间距离由3.4Å增高到5Å，所以DNA分子长度增长至原来的1.5倍。
    • 参与DNA配对和链交换的三种可能性：
      • ①两条DNA分子序列互补； ②至少有一条DNA分子上有能够让RecA组装的单链DNA区域； ③在互补区内存在DNA断裂末端，通过链交换组成新的相互缠绕的双链DNA。
    • 特点
      • a.RecA结合与组装到单链DNA的速度远快于组装到双链DNA上的速度； b.RecA组装有方向性（极性） c.RecA在3’端加入到纤丝速度远快于5’ d.3‘端延长的DNA单链分子更易于被RecA包裹， RecA亚基沿着5’3’方向延长。
    • 在RceA蛋白丝里建立新的配对DNA
      • 蛋白丝结构具有两个不同的DNA结合位点： 主要位点（结合单链） 次要位点（结合双链）←与DNA序列无关 与RecA结合的三链结构被称为“三联连接分子”，通常含有数百个碱基对的杂合DNA
      • 仅15个碱基的序列配对就可以为RecA蛋白丝发现同源区域的信号，启动链交换
      • 完成链交换的同时，要求新配对的碱基链相互缠绕，形成正确的双螺旋。
    • 所有生物都有RecA同源物
      • 真细菌的RecA 古细菌的RadA 真核生物的Rad51和Dmc1 噬菌体T4的UvsX蛋白
  • RuvAB复合体
    • RuvAB复合体特异性识别Holiday联结体的蛋白并促进分支移动
      • 1）重组链完成入侵，两个重组DNA分子被一个DNA分支连接起来，形成Holiday联结体； 2）分支点的移动增加了遗传物质的交换量； 3）RuvA蛋白是一个特异性结合Holiday联结体的蛋白(与序列无关)，并募集RuvB蛋白。 4）RuvB蛋白是一个六聚体ATP解旋酶，提供能量，并沿着DNA分支进行链交换
  • RuvC
    • 剪切Holliday联结体的特定DNA链结束重组
      • 1）RuvC识别Holiday联结体，特异地在两条同一方向的同源DNA链打开缺口，形成5`端磷酸基团末端和3`-OH 末端，这些末端可以直接被DNA连接酶接上； 2）通常剪切只发生在与5`-A/T-T-T-G/C符合的序列的位点。这类序列平均每64个核苷酸就有一个，保证了Holiday联结体拆分前至少发生部分分支移动； 3）根据剪切链的不同，连接后可以产生crossover或non-crossover产物。
• 六、同源重组机制的遗传结果
  • ①同源重组的一个重要的特点：无论是何种序列，只要有足够的相似区域，就可以发生在任何两个DNA区域间； ②任何两个基因间的重组频率和这些基因间的距离成正比； ③有些同源重组有序列偏好，重组概率高的区域叫‘热点’，反之叫‘冷点’； 如靠近Chi位点和Spo11剪切位点的区域是热点 ④重组可以导致遗传交换（减数分裂期）和基因转换（交配型转换）。
  • 中间有“热点”的两个基因在遗传图上要比在物理图上的同一区域相距更远，反之，中间有“冷点”的两个基因在遗传图上要比在物理图上的同一区域相距更近。
• 五、交配型的转换
  • 交配型基因
    • 酿酒酵母是单细胞真核生物，3种不同的细胞类型 (a型，α型，a/ α型)生存。
    • ①酿酒酵母单倍体细胞有两种交配型a或α。当a或α细胞接近时，融合（即交配）形成一个a/α双倍体。 交配型基因座（mating-type locus，MAT locus）：可表达的交配型基因的区域 ③a细胞中，a1基因出现在MATa基因座上；在α细胞中，α1和α2基因出现在MATα基因座上。 其他位置HMR 和HML 上的基因不表达。 如果重组发生在MAT和HML位置上，a细胞就会转换成α细胞 如果重组发生在MAT和HMR位置上，α细胞就会转换成a细胞。
  • 交配型转换的重组模型
    • ①特定位点的双链DNA断裂（HO内切核酸酶）起始交配型转换； ②HO内切酶识别交配型基因座，将DNA切割(5’→3’)形成粘性末端；（重组位点引入DSB）；（与Spo切割相比，HO只是水解DNA，并不与DNA断裂处共价相连） ③HO内切酶只能识别和切割MAT上的序列，所以交配型转换是单向性的即序列信息只能从HMR和HML‘移到’MAT基因座； ④Rad51结合MAT基因座的3’单链区，选择HMR或HML基因座的DNA进行链入侵； ⑤以HMR基因座序列为模板，复制完整序列；
  • 交配型转换是一种基因转变事件，与交换无关
• 四、真核细胞的同源重组
  • 在减数分裂过程中发生的同源重组叫减数分裂重组
    • 在减数分裂过程中发生的同源重组叫减数分裂重组
  • Spo11
    • 特点
      • 为了完成减数分裂，细胞需要启动特殊基因，如Spo11，其编码蛋白可引入染色体DNA的双链断裂，并启动重组。
      • Spo11没有序列特异性，但只有在已经复制的同源染色体开始进行配对的时候切割DNA。
      • Spo11多分布在核小体包装疏松区域，如基因转录启动子区域。
      • Spo11引起的双链断裂越多，重组发生的频率也越高。
    • 切割机制
      • ①Spo11蛋白中有一个特异的酪氨酸侧链攻击磷酸二酯键骨架，从而切断DNA，并形成蛋白质-DNA共价复合物(共价连接) ②Spo11的两个亚基在两个DNA链的相差2个核苷酸处切开，形成交错的双链断裂； ③DNA的5’断端与Spo11结合，起始了单链的产生。 减数分裂停止后，DNA分子重新连接。
  • MRX蛋白
    • 结构和功能
      • 是由MreII、Rad50和Xre2三个亚基组成的DNA核酸酶。 MRX酶作用于被切开的DNA末端，形成3’-DNA单链区，以组装类RecA的链交换蛋白。
    • 作用机制
      • ①Spo11催化DNA双链断裂生成3`端单链区。在减数分裂重组中，MRX酶复合物负责催化5’- 3’端的降解，并去除与DNA相连的Spo11。MRX酶复合物作用与RecBCD类似。（3’端的DNA链不被降解） ②与细菌RecA同源的链交换蛋白质Rad51和Dmc1结合在单链DNA尾上。 Rad51和Dmc1之间的相互作用尚不清楚。
      • MRX酶复合物负责催化DNA断裂的DNA产生很长的3'段单链
  • Rad51和Dmc1
    • 在真核细胞中已经发现了两种与细菌RecA蛋白同源的蛋白质：Rad51和Dmc1，在减数分裂重组中发挥重要作用。 Rad51在进行有丝分裂和减数分裂的细胞中广泛表达，而Dmc1则仅在细胞进入减数分裂时被表达。依赖Dmc1的重组倾向于发生在非姊妹染色单体之间。 减数分裂重组可能是通过促进同源染色体的交联，而帮助待分离的同源染色体间的联会。
  • 多种蛋白质共同促进减数分裂重组
    • 大型蛋白质-DNA复合体被称为”重组工厂“
• 一、DNA断裂频发并启动同源重组
  • 子主题
    • DSB:双链断裂 HR:同源重组 NHEJ:非同源末端链接 SDSA:合成依赖性链退火
  • 意义
    • ①重组可以产生遗传变异，维持生物种群的多样性 ②染色体瞬间的物理连接，对染色体正确分离到子代细胞中至关重要。（减数分裂时） ③可用于DNA损伤和复制叉停止的修复，还可以影响基因表达。
• 原核与真核生物同源重组的不同点 发生时期不同：真核生物的基因重组发生在减数分裂期间，或染色体损伤时。原核生物不发生减数分裂，它的同源重组发生于细菌进行融合（conjugation）、导入（transduction）或是转型（transformation）的过程中。 发生同源重组的片段不同：真核生物可以发生同源染色体之间的基因互换,也可以发生非同源染色体的重组。而原核生物的同源重组发生在一个完整的环状双螺旋DNA分子与一个双链或单链DNA分子片段之间。 同源重组需要的酶不同：原核生物需要RecA、RecBCD等。真核生物细胞需要Rad51, MRX等。
• 非姐妹染色单体之间的重组是由Dmc1介导的
• 在原核同源重组中存在8个碱基组成的Chi位点(GCTGGTGG); RecA、RecBCD参与重组。 RecBCD复合体具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位点产生单链3’游离末端。 RecA是一种单链DNA结合蛋白，可催化一个双链DNA分子的3`末端单链区侵入另一个双链DNA分子，形成异源双链区，同时置换出同源单链，形成Holliday结构。 RuvAB复合体特异性地识别Holliday结构并促进异源双链的形成（促进分枝移动）。 RuvC是一种内切酶，可以识别Holliday结构并剪切DNA，从而终止重组。