医用细胞生物学第三章细胞生物学的研究方法

细胞生物学是在显微、亚显微和分子水平三个层次上，研究细胞的结构、功能和各种生命规律的一门科学。细胞生物学由细胞学发展而来，细胞学是关于细胞结构与功能(特别是染色体)的研究。本思维导图是对医用细胞生物学第三章细胞生物学的研究方法的知识梳理，干货满满，赶快收藏学起来吧！

第三章 细胞生物学的研究方法

• 细胞的分离和培养
  • 实体组织细胞的分离
    • 机械方法将组织打散为小块
    • 消化法：用胰蛋白酶、胶原酶或胰蛋白酶EDTA等消化细胞之间的间质和黏附蛋白组分，使细胞松散
  • 不同类型细胞的分离
    • 离心法——密度梯度离心法
    • 流式细胞术
      • 每秒20000个细胞
      • 筛选纯度95%
    • 免疫磁珠法
      • Fe2O3或Fe3O4颗粒+单克隆抗体=免疫磁珠
    • 激光俘获显微切割
  • 细胞培养
    • 概念：从机体中取出组织或细胞，模拟体内的生理环境，使之能够继续生存、生长和增殖的一种方法
    • 原代培养：直接从体内获取的组织或细胞进行首次培养
    • 传代培养：当原代细胞经增殖达到一定密度以后,将细胞分散,从一个培养基以一定的比例转移到另外的一个或几个容器中的扩大培养
    • 细胞系：在培养的细胞中产生“不死”的变异细胞,这种细胞可以无限繁殖、传代,称为细胞系
    • 细胞株：用细胞克隆化的方法进一步改善细胞系的均一性,即分离出单个细胞使之增殖形成的细胞群
• 细胞功能基因组学研究技术
  • 基因表达的定量分析
    • 印迹杂交技术是定量检测基因表达变化的基本方法
    • 原位杂交可提供1基因表达的时空信息
    • 荧光实时定量PCR技术是检测基因表达的常规方法
  • 基因表达的上调和下调技术
    • 外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要方式
    • RNA干扰技术是下调基因表达的常用方法
    • CRISPR/Cas9 基因编辑技术
  • 蛋白质相互作用的研究技术
    • 免疫沉淀可验证蛋白质-蛋白质相互作用
    • 酵母双杂交用于筛选存在相互作用的蛋白质
    • 噬菌体展示可筛选存在相互作用的蛋白质
  • 蛋白质与核算相互作用的研究
    • 染色质免疫沉淀技术研究DNA与蛋白质相互作用
    • 紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合蛋白相互作用
  • 生物芯片技术
  • 蛋白质组学技术
  • 高通量测序技术
  • 单细胞测序技术
  • 模式动物个体水平的基因操作技术
• 细胞化学和细胞内分子示踪技术
  • 细胞化学技术
    • 一类将细胞形态观察和组分分析相结合的分析方法,是在保持组织原有结构的情况下利用生物大分子、小分子、无机离子的物理、化学特性来研究它们在细胞内的分布、数量及动态变化
  • 酶细胞化学技术
    • 通过酶对特异底物的反应并显色来检测酶在器官、组织和细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术
    • 原理：酶和底物结合
    • 检测方法：光度计、光镜、电镜等
  • 免疫细胞化学技术
    • 免疫荧光化学技术
      • 免疫荧光镜检术是将免疫学原理引入到荧光细胞化学技术中,利用带有荧光标记的抗体(或抗原）与细胞内特异性的抗原(或抗体)相结合,并采用荧光显微德技术对其进行定性、定位和定量研究的技术
    • 胶体金标记抗体
    • 酶标记抗体
    • 反应方式
      • 直接反映——标记物标记一级抗体
      • 间接反应——标记物标记二级抗体，可增强信号强度
  • 放射自显影技术
    • 原理：用放射性同位素标记生物样品中的大分子或其前体物质，然后通过乳胶感光（卤化银还原成为银原子），显示出被标记物在组织和细胞内的位置、数量及其变化
    • 同位素
      • 核重量不同
      • 核外电子数相同，化学性质相同
    • 放射性同位素
      • 可衰变释放出a、b或g射线而被检测
      • 常用放射性同位素：14C、3H、35S、32P
        • 3H-亮氨酸和35S-蛋氨酸——蛋白质
        • 3H-岩藻糖和3H-甘露醇——糖类
        • 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷、3H-胸苷或3H-尿苷——核酸
    • 操作步骤
      • 放射性化合物掺入活细胞
      • 不同时间取样制备切片
      • 暗盒中曝光
      • 显影和定影
    • 应用：对生物样品中放射性同位素标记的某种分子进行定性或定量检测
  • 活细胞内分子示踪
    • 离子探针
      • 原理：一些染料专一地与某种离子结合后会产生荧光或改本身荧光的发射波长与强度，从而通过荧光可以显示该离子的量
      • 应用：细胞内离子的实时监测
• 细胞化学和细胞内分子示踪技术
  • 细胞裂解
    • 均浆破碎法
    • 化学裂解法
      • 利用表面活性剂、螯合剂、脂溶性溶剂等化学试剂处理细胞,使细胞膜裂解,从 而释放出细胞组分和细胞器(提取质粒)
      • 此方法效率较低,一般辅助匀浆法,添加的化学试剂会干扰分析,在细胞裂解后要注意清除
    • 反复冻融法
      • 将细胞急速冷冻(超低温冰箱或液氬)后在室温或37℃缓慢融化,此冻结融化方式反复3~4次,使细胞破碎
      • 对存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞內产物释放较为有效
    • 超声波破碎法
      • 声波细胞破碎仪具有能发射一定频率超声波的探头,用这种探头处理细胞悬浮液,液体介质能在超声波的作用下发生空化作用,产生极大的冲击波和剪切力,使细胞破碎
      • 超声波破碎法的适用范围广,作用时间短,但操作中会产生热量,需注意冷却
  • 细胞组分的分离纯化
    • 差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒
      • 方法：从低速到高速逐级沉降
      • 分离对象：体积、质量差别较大的颗粒
    • 速度沉降分离沉降系数不同的颗粒
      • 方法:在离心管中制备由顶部到底部逐渐増加的蔗糖溶液密度梯度(通常5%~20%)
      • 分离对象:沉降系数不同的颗粒
    • 平衡沉降分离密度不同的颗粒
      • 方法:在离心管中制备由顶部到底部髙浓度差的蔗糖或氯化铯溶液密度梯度,匀浆中不同组分沉降至于自身密度处不再移动,形成沉降带
      • 分离对象:密度不同的颗粒
    • 蛋白质的分离和鉴定
      • 蛋白质电泳法分析、鉴定蛋白质
        • 原理：蛋白质带有净电荷，具有不同形状、大小及净电荷的蛋白质分子在电脑城中会产生不同的迁移速率，进而被分离
        • SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
          • 支持体：聚丙烯酰胺
          • 样品处理：
          • 分离原理：依据分子量的不同分离蛋白质
        • 等电聚焦电泳
          • 支持体：丙烯酰胺凝胶
          • 分离原理：依据等电点不同分离蛋白质
        • 双向电泳
          • 分离原理:等电聚焦与 SDS-PAGE结合
          • 应用1：可以一次分离数千种蛋白
      • 柱层析法纯化蛋白质
        • 离子交换层析
          • 填充基质:离子交换树脂
          • 分离原理:电荷不同
        • 凝胶过滤层析
          • 填充基质:多孔性凝胶颗粒
          • 分离原理:大小不同
        • 疏水性层析
          • 填充基质:带有疏水性基团的颗粒
          • 分离原理:疏水性不后
        • 亲和层析
          • 填充基质:结合有酶底物、特异性抗体或抗原的颗粒
          • 分离原理：亲和力不同
    • 核酸的分离纯化与鉴定
      • 凝胶电泳分离、纯化核酸
        • 琼脂糖凝胶电泳
          • 分离原理：核酸分子中的每个单核苷酸都带有一个负电荷，在电场中向阳极移动
          • 支持体：琼脂糖
          • 应用：分离不同大小的DNA分子
• 显微镜技术
  • 显微结构观察
    • 光学显微镜
      • 光学显微镜基本结构
        • 机械部分
          • 镜座
          • 镜臂
          • 镜柱
          • 镜筒
          • 镜台（载物台）
          • 物镜转换器（转换盘)
          • 调焦器
        • 照明部分
          • 光源
          • 集光器
          • 光圈
        • 光学部分
          • 目镜
          • 物镜
      • 普通光学显微镜
        • 分辨率
          • 横向分辨率Rxy=0.61 l/n·sinB
          • 纵向分辨率Rz=2l/(n·sinθ)^2
          • 最大分辨率=061×527/1.5×sn(140/2)≈230nm
        • 成像原理：倒立放大虚像
        • 放大率——最终成像大小与原物体大小比值
          • 总放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数
          • 最大放大倍数=
        • 普通光学显微镜标本制备技术
          • 非切片法:不用切片机或不经过切片步骤的制片方法
            • 类型:涂片法、铺片法、压片法、撕片法、磨片法
            • 优点:该类方法操作简单快捷,是标本制备中的常用手段
            • 缺点:应用范围有限,主要针对新鲜材料,操作时容易使材料的正常位置发生改变,通常制成的标本不能长期保存
          • 切片法：将标本进行切片后，制成玻片标本在观察的方法
      • 特殊光学显微镜
        • 倒置显微镜
          • 照明系统及聚光器位于载物台的上方,物镜位于载物台的下方,光路走向从上至下
          • 载物台上允许放置大而厚的标本
          • 倒置显微竟主要用于观察培养的活细胞
        • 相差显微镜
          • 原理：把透过标本的可见光的光程差（相位差）变成振幅差（明暗差）
          • 主要用于观察活细胞
        • 荧光显微镜
          • 正常荧光显微镜
          • 倒置荧光显微镜
          • 通过荧光分子吸收特定波长的光（激发光）后，发出更长波长的可见光（发射光）
            • 原理:以不同波长的激发光源照射硏究物体,使之携带的荧光物质发射荧 光,然后在显微镜下观察物体的形态及其所在的位置
            • 特点
              • 光源不直接照明,而是激发能源;
              • 需特殊的两组滤光片
              • 需特殊的分光镱(二向色镜）
            • 用途：定性、定量和定位的研究组织细胞内被荧光标记的物质既可以观察切片,也可以对活细胞内分子的动态变化进行实时观察
        • 共聚焦激光显微镜
          • CLSM工作原理
            • 光源:单色激光
            • 共聚焦：物镜和聚光镜互相共焦点,只有从标本焦面发出的光线聚焦成像,焦面以外的漫射光不参加成像
            • 成像过程:逐点扫描
        • 暗视野显微镜
          • 散射光成像，聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射光和衍射光进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体边缘是亮的
          • 特点
            • 只能观察物体的轮廓,分辨不清内部的细微结构
              • 分辨率高比普通显微镜高50倍
          • 用途:观察微小的颗粒及其运动状态
        • 偏光显微镜
          • 原理:利用偏振光检测興有双折射性
          • 特点与用途
            • 鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、橫纹肌和毛发等
            • 细胞中的蛋白质纤维、纺锺体、胶原、染色体
            • 在地质学等理工科专业中有重要应用
        • 微分干涉相差显微镜
          • 原理：相差显微攏+偏光显微橇
          • 特点与用途
            • 能显示结构的三维立体影像,,特别是一些较大的细胞器如核、线粒体等的图像立体感特别强
            • 能显示结构的三维立体影像,,特别是一些较大的细胞器如核、线粒体等的图像立体感特别强
            • 适合于显微操作,用于进行基因注入核移植、转基因等的显微操作
  • 亚显微结构观察
    • 电子显微镜
      • 发明：1933年 路斯卡（Ruska）德国
      • 透射电镜
        • 基本结构
          • 电子束照明系统:电子枪和聚光镜
          • 成像系统:物镜、中间镜和投影镜
          • 真空系统:真空泵
          • 记录系统:荧光显示屏、CCD、感光胶片
        • 成像原理
          • 电子枪激发出的电子束经过电磁透镜后加速,穿过样品后投射在观察的荧光屏上
          • 穿过样品的的电子多,屏亮,称为“低电子密度”
          • 穿过样品的的电子少,屏暗,称为“高电子空度”,由此形成具有反差的电子显微图像
        • 标本制备
          • 固定:双重固定—锇酸固定脂类醛固定蛋白
          • 脱水:含水标本干扰观察
          • 包埋:环氧树脂是常用包埋剂
          • 切片电子的穿透力有限,需制作超薄切片,厚度通常50~100nm
          • 染色:生物分子散射电子能力弱,需通过重金属染色,增大反差,常用锇、铀、铅等重金属的盐类
      • 扫描电镜
        • 成像原理
          • 通过电子束照射在标本后产生的二次电子成像
          • 二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关
        • 成像过程
          • 电子枪激发出的电子束经过电磁透镜后加速形成一束极细的电子“探针”,对样品表面进行扫描;样品表面被激发出次级电子
          • 次级电子信号被探测器收集,信号经放大后,显示出与电子束同步的扫描图像
        • 用于细胞整体或组织的观察
    • 标本特殊处理方法
      • 金属投影法( metal shadowing)
        • 原理:以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示投影效果,给出样品表面三维结构
        • 应用:观察蛋白、核酸类大分子,病毒颗粒及细胞壁
      • 冰冻断裂( freeze- fracture)
        • 样品制备：样品快速冷冻→冰刀从脂双层疏水部分撬开→暴露膜内部构造
        • 应用：观察细胞膜性内部构造
      • 冰冻蚀刻( freeze-etch)
        • 样品制备:冷冻组织→冰刀撬组织→真空中升华→暴露膜结构→复膜
        • 应用:观察细胞的内部构造
      • 冷冻电镜技术
        • 主要步骤
          • 样品冷冻(保持蛋白溶液态结构）
          • 冷冻成像(获取二维投影图像)
          • 三维重构(从二维图像通过计算得到三维密度图)
        • 特点：不需要大量样品,不需要结晶,即可迅速解析大型蛋白复合体原子分辨率三维结构