蛋白质

关于基础生物化学蛋白质章节的思维导图，主要内容有一、蛋白质的化学组成二、蛋白质的基本结构单位——氨基酸三、肽四、蛋白质的分子结构等。

蛋白质

• 一、蛋白质的化学组成
  • 1、元素组成：
    • C，H，O，N，S＋其他
    • 蛋白质的平均含氮量为16％→凯氏定氮法：蛋白质含量＝蛋白氮x6.25
  • 2、蛋白质的基本结构单元
    • 氨基酸，常见氨基酸有20种
    • 多个氨基酸，经首尾连结→多肽链，经折叠卷曲→蛋白质
• 🤗二、蛋白质的基本结构单位——氨基酸
  • 1、氨基酸的分类
    • 🤔蛋白质中常见的氨基酸 （20种）
      • 组成蛋白质的氨基酸都为***（除脯氨酸Pro） a-氨基酸→是与羧基相连的a-碳原子上都有一个氨基 组成蛋白质的氨基酸都为L型（除Gly谷）***
        • 各种a-氨基酸的区别在于侧链R基不同
      • ※※按R基团的极性性质分为
        • 非极性氨基酸（8种） →在水中的溶解度比极性氨基酸小，其中Ala的最小
          • 带有脂肪烃侧链的氨基酸（4种）：Ala（丙A）,Val（缬V）,Leu（亮L）,Ile （异亮I）
          • 含芳香环氨基酸（2种）：Trp（色W），Phe（苯丙F）
          • 含硫氨基酸（1种）：Met（甲硫M）
          • 亚氨基酸酸（1种）：Pro（脯P）
        • 极性氨基酸（12种）
          • 非解离的极性氨基酸（不带电，7种 ）
            • Ser（丝S），Thr（苏T），Tyr（酪Y），Asn（天冬酰胺D），Gln（谷氨酰胺Q），Gys（半胱C），Gly（甘G）
          • 碱性氨基酸（带正电，3种）
            • Lys（赖K），Arg（精R），His（组H）
          • 酸性氨基酸（带负电，2种）
            • Asp（天冬氨酸D）， Glu（谷E）
      • 由氨基酸的营养需求 分为
        • 非必需氨基酸
        • 必需氨基酸（8种） ：赖氨酸K（Lys）、色氨酸W（Trp）、苯丙氨酸F（Phe）、甲硫氨酸M（Met）、苏氨酸T（Thr）、异亮氨酸I（Ile）、亮氨酸L（Leu）、缬氨酸V（Val）
    • 蛋白质中的稀有氨基酸（4种）
    • 非蛋白质氨基酸
  • 2、氨基酸的理化性质
    • 光学性质
      • 旋光性质：除Gly（甘）之外，其余蛋白质氨基酸都有手性碳原子，都具有旋光性
      • 紫外吸收：Trp（色），Tyr（酪），Phe（苯丙）的R基含有苯环共轭双键系统，最大吸收峰分别在280nm，275nm，257nm ***！！！ 蛋白质→一般最大光吸收波长在280nm（A280）→分光分度法
    • 酸碱性质
      • ！！！两性解离和等电点
        • 氨基酸同时含有氨基（碱性）和羧基 （酸性）
        • （氨基酸的特征常数） ！！！氨基酸的等电点 （PI）：使氨基酸净电荷为零时溶液的PH值→处于等电点时的氨基酸在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动
        • ！！！氨基酸等电点的计算公式→PI＝1／2｛pKn＋pK（n＋Ⅰ ）｝ 其中n为可解离的正电荷基团数目
        • ！！！等电点的计算***
          • pH＞pI带负电，移向正极
          • ＜ 正电，移向负极
          • ＝ 不带电，不移动
  • 3、氨基酸重要的化学性质
    • ①茚三酮反应：茚三酮＋a-氨基酸在弱酸性溶液共热→生成紫色物质 脯氨酸（Pro)的羟脯氨酸＋茚三酮→不释放NH3，直接生成黄色化合物
      • 用于氨基酸的定性，定量分析
    • ②Sanger反应：DNFB＋氨基酸的a-氨基在弱碱溶液中→生成黄色的DNP-AA
      • 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸，也可用于蛋白质的测序
    • ③Edman反应
      • • 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸，也可用于蛋白质的测序
• 三、肽
  • 1、肽与肽键
    • 肽：是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而形成的化合物 肽键：氨基酸之间脱水形成的酰胺键（共价键）
    • ！！！肽的结构：
      • ① 无分支的长链
      • ② 具有方向性。两个末端分别是N端（氨基端）和C端（羧基端）
      • ③由“N-C-C”单元的周期性连接，构成多肽链的主链；氨基酸残基的R基团连接在主链的Ca上，形成多肽链的侧链。
    • 肽的表示法
      • ①中文表示法 ：规定从肽链的N端氨基酸开始，残基称氨酰，如：某氨基酰某氨基酰……某氨基酸
      • ② 三字母表示法：aa1 - aa2 - aa3 - aa4 - …… aa1 . aa2 . aa3 . aa4 . ……
      • ③ 单字母表示法：ABCD ……
    • ※！！！肽键 ：可看作一种酰胺键，高稳定性，肽键C-N键介于单键和双键之间 X射线衍射分析证实：肽键（C-N键）具有部分双键的性质，肽键不能自由旋转，使得……几乎处于同一平面内，这个刚性平面称为酰胺平面（肽平面）→需要大量氨基酸的原因
  • 2、肽的理化性质
    • 两性解离
      • 肽的酸碱性质主要取决于肽链中的游离末端-NH2和-COOH以及侧链R基上的可解离基团
    • 肽的等电点
      • 是在所有可解离的基团的净电荷＝0时的状态
    • 肽的颜色反应
      • 茚三酮
        • 用于肽的定性，定量
      • Sanger试剂
        • 用来鉴定，分析肽的N端氨基酸
      • Edman试剂
        • 用来鉴定，分析肽的N端氨基酸
  • 3、生物体内重要的肽
    • 还原型谷胱甘肽（GSH）
    • 氧化型谷胱甘肽（GSSG）
• 🙉四、蛋白质的分子结构
  • 1、初级结构（共价结构） →决定着蛋白质的高级结构
    • 一级结构
      • 定义：是指肽链中的氨基酸排列顺序
      • 蛋白质一级结构测定步骤：肽链数目的确定，拆分→断裂链内二硫键→氨基酸组成分析→分析N,C端→断裂成肽段→测序→排列→确定二硫键
      • 举例：胰岛素，核糖核酸酶
  • 2、高级结构（空间结构）
    • 二级结构🤔※
      • 定义：是指蛋白质的多肽主链折叠成有规则的重复构象
      • 构型和构象
        • 构型 →其的改变伴随着共价键的断裂和重新形成
          • 定义：是指不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排布（D-构型、L-构型）
        • 构象 →其改变不需要共价键的断裂和重新形成
          • 定义：是指相同构型的化合物中，与碳原子相连的各原子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布。
            • 交叉型构象最稳定
            • 重复型构象最不稳定
            • ！！！制约蛋白质大量构象形成的原因：因为主链有1／3具有部分双键性质的C-N键，不能自由旋转，且还受在单链旋转时产生空间位阻和静电效应的影响
          • X-射线衍射技术研究表明，肽键C-N键介于单键和双键之间，具有部分双键性质，不能自由旋转，其中决大多数都形成刚性的酰胺平面结构。
      • 酰胺平面 ※😂🤔
        • 定义：由肽键周围的6个原子组成的刚性平面
        • 虽是单键却有双键性质 周边六个原子在同一平面上 前后两个a-carbon在对角
        • 两个相邻酰胺平面绕Ca的旋转
      • ※🤔二级结构的基本类型
        • a-螺旋
          • 其主要特点 ※记！！！
            • ①肽链中的酰胺平面绕Cα相继旋转一定角度形成α-螺旋，并盘绕前进。每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈；每圈间距0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm，旋转100°
            • ②螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；肽链上所有的肽键都参与氢键的形成，链中的全部C=O和N-H几乎都平行于螺旋轴,氢键几乎平行于中心轴（…外侧， …平行）
            • ③绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋。每个氨基酸残基的N-H都与前面第四个残基C=O形成氢键（…右手螺旋，…氢键 ）
            • ④） * α-螺旋遇到Pro就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸。（存在Pro…有“结节” ）
        • b-折叠
          • 定义：是由两条／多条伸展的多肽链靠氢键联结而……
          • 分类
            • 平行式b折叠（N端在同一端，氨基酸之间沿轴相距0.325nm ）
            • 反平行式b折叠→更稳定 （……不在……，……相距0.35nm）
          • 维持b-折叠结构稳定性的力——氢键（是在链与链之间形成的）
        • b-转角 （b-回折／b-弯曲）
          • 发现的多数处于球状蛋白质的表面
          • 两种类型
            • 相同：每种类型都有4个氨基酸残基
            • 不同：连接第2个残基与第3个残基的肽平面翻转180度
          • 氢键
          • 其特点是肽链回折180°，使得氨基酸残基的C=O和与第四个残基的N-H形成氢键。
        • 无规卷曲 （自由卷曲／无规则区域）
          • 定义：是指没有一定规律的松散肽链结构
          • 酶的功能部位常常处于这种构象区域
          • 无规卷曲常出现在a-螺旋与a-螺旋、a-螺旋与β-折叠、β-折叠与β-折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的
    • 超二级结构和结构域
      • 超二级结构
        • ※记定义：由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则，在空间上能辨认的二级结构组合体
        • 其有3种基本组合形式
          • aa：由两股或三股右手螺旋缭绕而成的左手螺旋
          • bab ：由两股折叠片，中间加入螺旋而形成的片层结构
          • bbb：由三条或更多的反平行式-链通过-转角或其它的肽段连接而成的结构
      • 结构域 （功能域）
        • 定义：指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体
        • 特点
          • 结构域之间有一段肽链相连——铰链区
          • 各个结构域可以相似或不相同
          • 结构域一般为酶活性中心
    • 三级结构
      • 定义：指的是多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成球状分子结构。
      • 其结构特点
        • ①蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。
        • ②具有三级结构的蛋白质分子含有多种二级结构单元。
        • ③大多数非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核；而极性侧链在分子表面，形成亲水面。（…非极性侧链→分子内部→疏水核 ……极性侧链→分子表面→亲水面 ）
        • ④分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋白质的活性中心（…内陷的空穴→蛋白质的活性中心）
      • ※！！！维持蛋白质三级结构的作用力
        • 共价键
          • 二硫键
        • 非共价键 （次级键）
          • 氢键
          • 范德华力
          • 疏水相互作用
          • 离子键（盐键）
      • 举例：肌红蛋白
    • 四级结构
      • 定义：由两条及以上具有三级结构的多肽链聚合而成、有特定三维结构的蛋白质构象
        • 亚基（亚单位）→每个折叠的多肽链
        • 寡聚蛋白质→由两个及以上的亚基组成的蛋白质
      • 其结构特点
        • 对称性
        • 增强结构稳定
        • 具有协同性和别构效应
      • 维持四级结构的作用力
        • 疏水作用
        • 氢键
        • 离子键（盐键）
        • 范德华力
      • 举例：血红蛋白
        • 血红蛋白的氧合曲线是S型曲线
• （简答）！！！五、蛋白质的结构与功能的关系
  • 1、一级结构与功能的关系
    • 蛋白质的一级结构与分子进化
      • 保守部位：分子中保持氨基酸残基不变的区域→是完成其生物学功能所必需的
      • 完成其功能所必需的保守部位的氨基酸不会改变
      • 密切相关的物种／种属来源越接近的物种，其细胞色素c的一级结构的差异相对较小
    • 蛋白质的一级结构与分子病
      • 分子病定义：指由于遗传基因突变导致蛋白质分子中某些氨基酸序列改变，从而造成蛋白质功能发生变化的一种遗传病
      • 例：镰形细胞贫血病（第一个发现因蛋白质中单个氨基酸突变导致的遗传疾病） 正常Glu（谷）→患病Val（缬） 患病原因：Glu侧链带负电荷，Val侧链是一个非极性基团，所以使得HbS（血红蛋白）分子表面的负电荷减少，使患者的HbS 容易聚集并形成杆状多聚体
    • 多肽链的局部断裂与蛋白质前体激活
      • 蛋白质的前体激活：以无活性的前体形式存在→经特定蛋白质酶水解，切除部分肽段后→转变为有活性的蛋白质
      • 举例：有活性胰岛素→的前体→ 胰岛素原（无活性）→的前体→前胰岛素原 信号肽：前胰岛素原比胰岛素原在N端上多一段肽链
  • 2、高级结构与功能的关系
    • 蛋白质的变性与复性
    • 核糖核酸酶（RNase A）的变性与复性
      • 其变性→在8mol／L尿素和b-巯基乙醇处理 →分子内4个二硫键即断裂，失去了催化RNA水解的功能
      • 其复性→用透析去除尿素和b-巯基乙醇→二硫键得以重建，活性恢复到原来的95％-100％
      • 表明RBase A活性取决于特定的三维构象
    • 血红蛋白的别构效应
      • 血红蛋白：是一种含有4个亚基的寡聚蛋白质
      • 别构效应：在其执行功能时，由于一个亚基构象的变化而引起其余亚基，以至整个分子的构象，性质和功能的变化
      • 肌红蛋白与血红蛋白
        • 两者三级结构相似别构效应
• 六、蛋白质的理化性质
  • 1、两性解离及等电点
    • 蛋白质的等电点（pI）：当溶液在某一PH条件下使蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即总净电荷为零时，其在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，这时溶液的pH
    • 利用蛋白质的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质
  • 2、胶体性质
    • 水膜：蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如-NH3、-COO-、-OH-、-SH、-CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成—层水膜。
    • 蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的原因：水膜+蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同的电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定的距离，不易互相凝集沉淀
    • 为啥叫蛋白质溶液，不叫蛋白质溶胶？由于蛋白质带了电荷和水膜
    • 蛋白质具有胶体性质，比如：布朗运动，光散射，电泳，不能透过半透膜（利用其性质的应用是透析）及具有吸附能力
  • 3、沉淀反应
    • 能使蛋白质沉淀的试剂有
      • 高浓度中性盐→中和蛋白质电荷：盐析（分离，制备蛋白质的常用方法）
      • 有机溶剂→破坏蛋白质水膜：比如丙酮，乙醇
      • 重金属盐→与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐：如Hg2＋，Ag＋，Pb＋
      • 生物碱试剂和某些酸类→与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐
      • 加热变性沉淀
      • 变性与沉淀的区别：变性→高级结构被打开，水化膜被破坏 沉淀→不一定破坏高级结构，也可以只是打开水化膜
  • 4、变性 和复性
    • 定义：…受影响，其空间结构发生变化（二，三，四级结构被破坏，并不导致蛋白质一级结构被破坏），性质与功能随之改变或丧失 （当一级结构被破坏了叫降解）
    • 蛋白质变性的因素：
      • ①物理因素：加热，紫外线等
      • ②化学因素：强酸，碱，尿 素，胍，浓乙醇
    • ！！！蛋白质变性的表现
      • ①生物活性丧失（酶）→主要特征
      • ②理化性质改变：溶解度降低，黏度增大，扩散系数变小（蛋清）
      • ③生物化学性质改变：对蛋白酶敏感性增大
      • ④基因位置改变
    • 蛋白质复性
      • 变性→透析→复性（但大多蛋白质变性后，很难复性） （与DNA复性对比P89）
  • 5、颜色反应
    • 双缩脲反应：双缩脲（肽键）＋硫酸铜＋碱性条件→产生紫红色络合物→用于定性鉴定蛋白质，也可在540nm处进行蛋白质的定量测定
    • 酚试剂（Folin酚试剂）反应→常在540nm进行定量测定蛋白质含量
    • 茚三酮反应：因为……有游离的a-NH2和a-COOH……
    • 考马斯亮兰
• 七、蛋白质的分离，纯化与鉴定
  • 1、蛋白质分离纯化的一般原则
    • ①前处理 （细胞处理）
    • ②粗分级
    • ③细分级（样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去）
    • ④结晶（是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶）
  • ！！！（简答）2、蛋白质分离纯化的一般方法
    • 根据蛋白质分子大小不同…
      • ①透析和超滤 →透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜 超滤：蛋白质分子不能通过半透膜＋增加压力／离心力）
      • ②密度梯度（区带）离心 ：……管底密度最大，向上密度逐渐减小
      • ③凝胶过滤层析（分子排阻层析／分子筛层析）：……大分子先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来
    • 区分！！！根据蛋白质溶解度的差异……
      • ①等电点沉淀：蛋白质在其等电点时溶解度最小
      • ②盐溶和盐析
        • 低浓度的中性盐（如硫酸铵）可以增强蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶
        • 盐析：当蛋白质溶液中的中性盐浓度达到一定饱和度时，能使蛋白质沉淀析出
    • 根据蛋白质电荷不同……
      • ①电泳
        • 定义：在电场中，带电颗粒向与其电荷相反的电极移动
        • 举例：聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）
      • ②离子交换层析：根据蛋白质两性解离的特点
    • 根据蛋白质的配体专一性进行亲和层析分离
  • 3、蛋白质相对分子质量的测定方法
    • ①超速离心分析法
    • ②凝胶过滤法
    • ③SDS-PAGE法
    • ④毛细管电泳法 （CE）
    • ⑤质谱法
• ！！！杂环氨基酸包括色氨酸（Trp，W），组氨酸（His）和脯氨酸（Pro）三种

蛋白质

• 一、蛋白质的化学组成
  • 1、元素组成：
    • C，H，O，N，S＋其他
    • 蛋白质的平均含氮量为16％→凯氏定氮法：蛋白质含量＝蛋白氮x6.25
  • 2、蛋白质的基本结构单元
    • 氨基酸，常见氨基酸有20种
    • 多个氨基酸，经首尾连结→多肽链，经折叠卷曲→蛋白质
• 🤗二、蛋白质的基本结构单位——氨基酸
  • 1、氨基酸的分类
    • 🤔蛋白质中常见的氨基酸 （20种）
      • 组成蛋白质的氨基酸都为***（除脯氨酸Pro） a-氨基酸→是与羧基相连的a-碳原子上都有一个氨基 组成蛋白质的氨基酸都为L型（除Gly谷）***
        • 各种a-氨基酸的区别在于侧链R基不同
      • ※※按R基团的极性性质分为
        • 非极性氨基酸（8种） →在水中的溶解度比极性氨基酸小，其中Ala的最小
          • 带有脂肪烃侧链的氨基酸（4种）：Ala（丙A）,Val（缬V）,Leu（亮L）,Ile （异亮I）
          • 含芳香环氨基酸（2种）：Trp（色W），Phe（苯丙F）
          • 含硫氨基酸（1种）：Met（甲硫M）
          • 亚氨基酸酸（1种）：Pro（脯P）
        • 极性氨基酸（12种）
          • 非解离的极性氨基酸（不带电，7种 ）
            • Ser（丝S），Thr（苏T），Tyr（酪Y），Asn（天冬酰胺D），Gln（谷氨酰胺Q），Gys（半胱C），Gly（甘G）
          • 碱性氨基酸（带正电，3种）
            • Lys（赖K），Arg（精R），His（组H）
          • 酸性氨基酸（带负电，2种）
            • Asp（天冬氨酸D）， Glu（谷E）
      • 由氨基酸的营养需求 分为
        • 非必需氨基酸
        • 必需氨基酸（8种） ：赖氨酸K（Lys）、色氨酸W（Trp）、苯丙氨酸F（Phe）、甲硫氨酸M（Met）、苏氨酸T（Thr）、异亮氨酸I（Ile）、亮氨酸L（Leu）、缬氨酸V（Val）
    • 蛋白质中的稀有氨基酸（4种）
    • 非蛋白质氨基酸
  • 2、氨基酸的理化性质
    • 光学性质
      • 旋光性质：除Gly（甘）之外，其余蛋白质氨基酸都有手性碳原子，都具有旋光性
      • 紫外吸收：Trp（色），Tyr（酪），Phe（苯丙）的R基含有苯环共轭双键系统，最大吸收峰分别在280nm，275nm，257nm ***！！！ 蛋白质→一般最大光吸收波长在280nm（A280）→分光分度法
    • 酸碱性质
      • ！！！两性解离和等电点
        • 氨基酸同时含有氨基（碱性）和羧基 （酸性）
        • （氨基酸的特征常数） ！！！氨基酸的等电点 （PI）：使氨基酸净电荷为零时溶液的PH值→处于等电点时的氨基酸在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动
        • ！！！氨基酸等电点的计算公式→PI＝1／2｛pKn＋pK（n＋Ⅰ ）｝ 其中n为可解离的正电荷基团数目
        • ！！！等电点的计算***
          • pH＞pI带负电，移向正极
          • ＜ 正电，移向负极
          • ＝ 不带电，不移动
  • 3、氨基酸重要的化学性质
    • ①茚三酮反应：茚三酮＋a-氨基酸在弱酸性溶液共热→生成紫色物质 脯氨酸（Pro)的羟脯氨酸＋茚三酮→不释放NH3，直接生成黄色化合物
      • 用于氨基酸的定性，定量分析
    • ②Sanger反应：DNFB＋氨基酸的a-氨基在弱碱溶液中→生成黄色的DNP-AA
      • 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸，也可用于蛋白质的测序
    • ③Edman反应
      • • 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸，也可用于蛋白质的测序
• 三、肽
  • 1、肽与肽键
    • 肽：是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而形成的化合物 肽键：氨基酸之间脱水形成的酰胺键（共价键）
    • ！！！肽的结构：
      • ① 无分支的长链
      • ② 具有方向性。两个末端分别是N端（氨基端）和C端（羧基端）
      • ③由“N-C-C”单元的周期性连接，构成多肽链的主链；氨基酸残基的R基团连接在主链的Ca上，形成多肽链的侧链。
    • 肽的表示法
      • ①中文表示法 ：规定从肽链的N端氨基酸开始，残基称氨酰，如：某氨基酰某氨基酰……某氨基酸
      • ② 三字母表示法：aa1 - aa2 - aa3 - aa4 - …… aa1 . aa2 . aa3 . aa4 . ……
      • ③ 单字母表示法：ABCD ……
    • ※！！！肽键 ：可看作一种酰胺键，高稳定性，肽键C-N键介于单键和双键之间 X射线衍射分析证实：肽键（C-N键）具有部分双键的性质，肽键不能自由旋转，使得……几乎处于同一平面内，这个刚性平面称为酰胺平面（肽平面）→需要大量氨基酸的原因
  • 2、肽的理化性质
    • 两性解离
      • 肽的酸碱性质主要取决于肽链中的游离末端-NH2和-COOH以及侧链R基上的可解离基团
    • 肽的等电点
      • 是在所有可解离的基团的净电荷＝0时的状态
    • 肽的颜色反应
      • 茚三酮
        • 用于肽的定性，定量
      • Sanger试剂
        • 用来鉴定，分析肽的N端氨基酸
      • Edman试剂
        • 用来鉴定，分析肽的N端氨基酸
  • 3、生物体内重要的肽
    • 还原型谷胱甘肽（GSH）
    • 氧化型谷胱甘肽（GSSG）
• 🙉四、蛋白质的分子结构
  • 1、初级结构（共价结构） →决定着蛋白质的高级结构
    • 一级结构
      • 定义：是指肽链中的氨基酸排列顺序
      • 蛋白质一级结构测定步骤：肽链数目的确定，拆分→断裂链内二硫键→氨基酸组成分析→分析N,C端→断裂成肽段→测序→排列→确定二硫键
      • 举例：胰岛素，核糖核酸酶
  • 2、高级结构（空间结构）
    • 二级结构🤔※
      • 定义：是指蛋白质的多肽主链折叠成有规则的重复构象
      • 构型和构象
        • 构型 →其的改变伴随着共价键的断裂和重新形成
          • 定义：是指不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排布（D-构型、L-构型）
        • 构象 →其改变不需要共价键的断裂和重新形成
          • 定义：是指相同构型的化合物中，与碳原子相连的各原子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布。
            • 交叉型构象最稳定
            • 重复型构象最不稳定
            • ！！！制约蛋白质大量构象形成的原因：因为主链有1／3具有部分双键性质的C-N键，不能自由旋转，且还受在单链旋转时产生空间位阻和静电效应的影响
          • X-射线衍射技术研究表明，肽键C-N键介于单键和双键之间，具有部分双键性质，不能自由旋转，其中决大多数都形成刚性的酰胺平面结构。
      • 酰胺平面 ※😂🤔
        • 定义：由肽键周围的6个原子组成的刚性平面
        • 虽是单键却有双键性质 周边六个原子在同一平面上 前后两个a-carbon在对角
        • 两个相邻酰胺平面绕Ca的旋转
      • ※🤔二级结构的基本类型
        • a-螺旋
          • 其主要特点 ※记！！！
            • ①肽链中的酰胺平面绕Cα相继旋转一定角度形成α-螺旋，并盘绕前进。每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈；每圈间距0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm，旋转100°
            • ②螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；肽链上所有的肽键都参与氢键的形成，链中的全部C=O和N-H几乎都平行于螺旋轴,氢键几乎平行于中心轴（…外侧， …平行）
            • ③绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋。每个氨基酸残基的N-H都与前面第四个残基C=O形成氢键（…右手螺旋，…氢键 ）
            • ④） * α-螺旋遇到Pro就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸。（存在Pro…有“结节” ）
        • b-折叠
          • 定义：是由两条／多条伸展的多肽链靠氢键联结而……
          • 分类
            • 平行式b折叠（N端在同一端，氨基酸之间沿轴相距0.325nm ）
            • 反平行式b折叠→更稳定 （……不在……，……相距0.35nm）
          • 维持b-折叠结构稳定性的力——氢键（是在链与链之间形成的）
        • b-转角 （b-回折／b-弯曲）
          • 发现的多数处于球状蛋白质的表面
          • 两种类型
            • 相同：每种类型都有4个氨基酸残基
            • 不同：连接第2个残基与第3个残基的肽平面翻转180度
          • 氢键
          • 其特点是肽链回折180°，使得氨基酸残基的C=O和与第四个残基的N-H形成氢键。
        • 无规卷曲 （自由卷曲／无规则区域）
          • 定义：是指没有一定规律的松散肽链结构
          • 酶的功能部位常常处于这种构象区域
          • 无规卷曲常出现在a-螺旋与a-螺旋、a-螺旋与β-折叠、β-折叠与β-折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的
    • 超二级结构和结构域
      • 超二级结构
        • ※记定义：由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则，在空间上能辨认的二级结构组合体
        • 其有3种基本组合形式
          • aa：由两股或三股右手螺旋缭绕而成的左手螺旋
          • bab ：由两股折叠片，中间加入螺旋而形成的片层结构
          • bbb：由三条或更多的反平行式-链通过-转角或其它的肽段连接而成的结构
      • 结构域 （功能域）
        • 定义：指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体
        • 特点
          • 结构域之间有一段肽链相连——铰链区
          • 各个结构域可以相似或不相同
          • 结构域一般为酶活性中心
    • 三级结构
      • 定义：指的是多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成球状分子结构。
      • 其结构特点
        • ①蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。
        • ②具有三级结构的蛋白质分子含有多种二级结构单元。
        • ③大多数非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核；而极性侧链在分子表面，形成亲水面。（…非极性侧链→分子内部→疏水核 ……极性侧链→分子表面→亲水面 ）
        • ④分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋白质的活性中心（…内陷的空穴→蛋白质的活性中心）
      • ※！！！维持蛋白质三级结构的作用力
        • 共价键
          • 二硫键
        • 非共价键 （次级键）
          • 氢键
          • 范德华力
          • 疏水相互作用
          • 离子键（盐键）
      • 举例：肌红蛋白
    • 四级结构
      • 定义：由两条及以上具有三级结构的多肽链聚合而成、有特定三维结构的蛋白质构象
        • 亚基（亚单位）→每个折叠的多肽链
        • 寡聚蛋白质→由两个及以上的亚基组成的蛋白质
      • 其结构特点
        • 对称性
        • 增强结构稳定
        • 具有协同性和别构效应
      • 维持四级结构的作用力
        • 疏水作用
        • 氢键
        • 离子键（盐键）
        • 范德华力
      • 举例：血红蛋白
        • 血红蛋白的氧合曲线是S型曲线
• （简答）！！！五、蛋白质的结构与功能的关系
  • 1、一级结构与功能的关系
    • 蛋白质的一级结构与分子进化
      • 保守部位：分子中保持氨基酸残基不变的区域→是完成其生物学功能所必需的
      • 完成其功能所必需的保守部位的氨基酸不会改变
      • 密切相关的物种／种属来源越接近的物种，其细胞色素c的一级结构的差异相对较小
    • 蛋白质的一级结构与分子病
      • 分子病定义：指由于遗传基因突变导致蛋白质分子中某些氨基酸序列改变，从而造成蛋白质功能发生变化的一种遗传病
      • 例：镰形细胞贫血病（第一个发现因蛋白质中单个氨基酸突变导致的遗传疾病） 正常Glu（谷）→患病Val（缬） 患病原因：Glu侧链带负电荷，Val侧链是一个非极性基团，所以使得HbS（血红蛋白）分子表面的负电荷减少，使患者的HbS 容易聚集并形成杆状多聚体
    • 多肽链的局部断裂与蛋白质前体激活
      • 蛋白质的前体激活：以无活性的前体形式存在→经特定蛋白质酶水解，切除部分肽段后→转变为有活性的蛋白质
      • 举例：有活性胰岛素→的前体→ 胰岛素原（无活性）→的前体→前胰岛素原 信号肽：前胰岛素原比胰岛素原在N端上多一段肽链
  • 2、高级结构与功能的关系
    • 蛋白质的变性与复性
    • 核糖核酸酶（RNase A）的变性与复性
      • 其变性→在8mol／L尿素和b-巯基乙醇处理 →分子内4个二硫键即断裂，失去了催化RNA水解的功能
      • 其复性→用透析去除尿素和b-巯基乙醇→二硫键得以重建，活性恢复到原来的95％-100％
      • 表明RBase A活性取决于特定的三维构象
    • 血红蛋白的别构效应
      • 血红蛋白：是一种含有4个亚基的寡聚蛋白质
      • 别构效应：在其执行功能时，由于一个亚基构象的变化而引起其余亚基，以至整个分子的构象，性质和功能的变化
      • 肌红蛋白与血红蛋白
        • 两者三级结构相似别构效应
• 六、蛋白质的理化性质
  • 1、两性解离及等电点
    • 蛋白质的等电点（pI）：当溶液在某一PH条件下使蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即总净电荷为零时，其在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，这时溶液的pH
    • 利用蛋白质的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质
  • 2、胶体性质
    • 水膜：蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如-NH3、-COO-、-OH-、-SH、-CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成—层水膜。
    • 蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的原因：水膜+蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同的电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定的距离，不易互相凝集沉淀
    • 为啥叫蛋白质溶液，不叫蛋白质溶胶？由于蛋白质带了电荷和水膜
    • 蛋白质具有胶体性质，比如：布朗运动，光散射，电泳，不能透过半透膜（利用其性质的应用是透析）及具有吸附能力
  • 3、沉淀反应
    • 能使蛋白质沉淀的试剂有
      • 高浓度中性盐→中和蛋白质电荷：盐析（分离，制备蛋白质的常用方法）
      • 有机溶剂→破坏蛋白质水膜：比如丙酮，乙醇
      • 重金属盐→与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐：如Hg2＋，Ag＋，Pb＋
      • 生物碱试剂和某些酸类→与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐
      • 加热变性沉淀
      • 变性与沉淀的区别：变性→高级结构被打开，水化膜被破坏 沉淀→不一定破坏高级结构，也可以只是打开水化膜
  • 4、变性 和复性
    • 定义：…受影响，其空间结构发生变化（二，三，四级结构被破坏，并不导致蛋白质一级结构被破坏），性质与功能随之改变或丧失 （当一级结构被破坏了叫降解）
    • 蛋白质变性的因素：
      • ①物理因素：加热，紫外线等
      • ②化学因素：强酸，碱，尿 素，胍，浓乙醇
    • ！！！蛋白质变性的表现
      • ①生物活性丧失（酶）→主要特征
      • ②理化性质改变：溶解度降低，黏度增大，扩散系数变小（蛋清）
      • ③生物化学性质改变：对蛋白酶敏感性增大
      • ④基因位置改变
    • 蛋白质复性
      • 变性→透析→复性（但大多蛋白质变性后，很难复性） （与DNA复性对比P89）
  • 5、颜色反应
    • 双缩脲反应：双缩脲（肽键）＋硫酸铜＋碱性条件→产生紫红色络合物→用于定性鉴定蛋白质，也可在540nm处进行蛋白质的定量测定
    • 酚试剂（Folin酚试剂）反应→常在540nm进行定量测定蛋白质含量
    • 茚三酮反应：因为……有游离的a-NH2和a-COOH……
    • 考马斯亮兰
• 七、蛋白质的分离，纯化与鉴定
  • 1、蛋白质分离纯化的一般原则
    • ①前处理 （细胞处理）
    • ②粗分级
    • ③细分级（样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去）
    • ④结晶（是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶）
  • ！！！（简答）2、蛋白质分离纯化的一般方法
    • 根据蛋白质分子大小不同…
      • ①透析和超滤 →透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜 超滤：蛋白质分子不能通过半透膜＋增加压力／离心力）
      • ②密度梯度（区带）离心 ：……管底密度最大，向上密度逐渐减小
      • ③凝胶过滤层析（分子排阻层析／分子筛层析）：……大分子先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来
    • 区分！！！根据蛋白质溶解度的差异……
      • ①等电点沉淀：蛋白质在其等电点时溶解度最小
      • ②盐溶和盐析
        • 低浓度的中性盐（如硫酸铵）可以增强蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶
        • 盐析：当蛋白质溶液中的中性盐浓度达到一定饱和度时，能使蛋白质沉淀析出
    • 根据蛋白质电荷不同……
      • ①电泳
        • 定义：在电场中，带电颗粒向与其电荷相反的电极移动
        • 举例：聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）
      • ②离子交换层析：根据蛋白质两性解离的特点
    • 根据蛋白质的配体专一性进行亲和层析分离
  • 3、蛋白质相对分子质量的测定方法
    • ①超速离心分析法
    • ②凝胶过滤法
    • ③SDS-PAGE法
    • ④毛细管电泳法 （CE）
    • ⑤质谱法
• ！！！杂环氨基酸包括色氨酸（Trp，W），组氨酸（His）和脯氨酸（Pro）三种