高中生物7生物技术与工程

该导图总结了高中生物选修三生物技术和工程的内容，包括发酵工程、细胞工程和基因工程。适合高二学生同步学习、高三一轮复习以及自学、准备教资使用。

生物技术与工程

• 发酵工程
  • 发酵
    • 指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程
  • 传统发酵技术
    • 原理
      • C6H12O6→酶 2C3H6O3（乳酸）+能量
        • 乳酸菌
          • 厌氧细菌
      • C6H12O6→酶 2C2H5OH（酒精）+2CO2+能量
        • 酵母菌
          • 单细胞真菌 兼性厌氧
      • C6H12O6+2O2→酶2CH3COOH(醋酸)+2H2O+2CO2+能量 C2H5OH+O2→酶CH3COOH（醋酸）+H2O+能量
        • 醋酸菌
          • 好氧细菌
    • 实验：制作传统发酵食品
      • 制作泡菜
        • 1.配制盐溶液 将2 L水烧开，加入100 g食盐，配置成5%的盐溶液，然后晾凉备用。 2.装坛 选一个用洗洁精洗干净的气密性好的坛子，喷洒医用酒精消毒。将处理好的蔬菜和香料放入坛中，加入盐水没过蔬菜，也可以加入少量生抽和白酒调味。但不要放的太满，不然泡菜水会随着气体的产生而溢出。用pH试纸测试初始pH值，记录在实验报告上。如果想发酵快一点可以加一些泡菜水或乳酸菌菌种，在坛檐上加水封坛，盖上盖子。封坛液也可用浓盐水或油代替，减缓蒸发。 3.发酵 将坛子放在室温下发酵，每天观察泡菜水浑浊程度和pH值的变化。 4.开坛品尝 9~ 10天后，将泡菜取出，带到学校与同学分享品尝，相互评价，请做得好吃的同学分享制作经验。
          • 整个泡菜坛子其实相当于一个选择培养基，最开始的几天蔬菜表面带有的耐盐好氧微生物在坛中大量繁殖，消耗掉了坛中氧气，产生二氧化碳形成厌氧环境。在厌氧环境中可以产生乳酸的一类细菌后程发力，产生大量乳酸
      • 制作果酒和果醋
        • 1.处理葡萄 将葡萄用清水洗净，除去果柄和腐烂的葡萄，放在料理机中打碎。再倒入用洗洁精洗净、医用酒精消毒的白口瓶中，盖上盖子。如果葡萄有籽，最好用手把葡萄捏破放进去，不然打碎的葡萄籽会把单宁释放到发酵液中，酒会变得很苦涩。撒一些酵母粉可以提高发酵效率。 2.发酵酒 将发酵瓶放入28℃的恒温箱中发酵，如果没有恒温箱也可以选择在气温达到20℃以上的室内。如果天气比较冷，可以放在暖气、火炉边上、或用被子包裹。每天观察记录发酵液的变化。 3.品尝酒 2~3天后就发酵成了甜酒，10天后因为酒精含量上升，导致杂质沉淀，发酵液变得澄清，葡萄酒就发酵好了。用纱布过滤掉酒糟后（酒糟不要丢弃），将酒带到学校与同学分享、品鉴，同时记得保留一部分样品存于冰箱中，用于后续的酵母菌纯培养实验。 4.发酵醋 将酒糟加水，或者将发酵好的酒加水稀释一倍后，用pH试纸检测初始pH值，接着罩上一层纱布，在30℃发酵。每天观察发酵液变化，用pH试纸检测pH值，记录在实验报告上，然后对发酵液进行搅拌通气，促进醋酸菌繁殖。加入醋曲可以提高发酵效率。 5.品尝醋 7天后，如果观察到发酵液表面长出了一层白膜，说明醋发酵好了。用纱布过滤，将醋带到学校与同学分享、品鉴，同时记得保留一部分样品存于冰箱中，用于后续的醋酸菌分离与计数实验。
  • 微生物的培养技术
    • 基本培养技术
      • 培养基的配置
        • 培养基
          • 定义
            • 供微生物生长繁殖的培养基质
          • 目的
            • 以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物
          • 分类
            • 液体培养基
              • 不含凝固剂（如琼脂）
            • 固体培养基
          • 成分
            • 水
            • 碳源
            • 氮源
            • 无机盐
            • 以及调节PH和氧气等
      • 无菌技术
        • 消毒
          • 使用较温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物
            • 煮沸消毒
            • 巴氏消毒
        • 灭菌
          • 使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子
            • 湿热灭菌
            • 干热灭菌
            • 灼烧灭菌
        • 消毒和灭菌后，许多操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行
      • 微生物的纯培养
        • 接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物，由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物
        • 实验：酵母菌的纯培养
          • 1.配制培养基 将100g土豆加400 mL水煮沸20分钟，纱布过滤。再加入10 g葡萄糖、10g 琼脂，溶解后加水定容至500 mL，配制成土豆培养基。将培养基的一部分分装到用于保藏菌种的试管中，占试管体积的1/3即可（选做）。其余的倒入锥形瓶中，将试管和锥形瓶塞上塞子。 2.灭菌 将培养基、培养皿、试管用旧报纸包裹起来，移液器吸头装入吸头盒。将这些耗材放入高压蒸汽灭菌锅中，在加压100kPa、121℃的条件下加热15分钟灭菌。灭菌结束后将耗材取出，等待冷却，其中装有培养基的试管应倾斜放置，待冷却后制成斜面保藏培养基。 3.倒平板 先对双手和桌面喷洒70~75%酒精消毒，待酒精挥发后点燃酒精灯。等培养基冷却到放到手背上感觉不烫的时候，开始倒平板。用左手拿起一套培养皿，中指托住下皿，食指和大拇指扣住上盖。右手拿锥形瓶在酒精灯火焰上掠过后，用左手小拇指拔下棉塞，将瓶口和培养皿口在火焰上掠过，然后用大拇指将培养皿的上盖打开一个小口，将培养基从开口处倒入培养皿（图2）。培养基铺满培养皿底部后，再次灼烧培养皿口和锥形瓶口，合上培养皿，塞上瓶塞，将培养皿放在桌面上，接着开始倒下一个平板，至少倒3个。 4.平板划线法接种 将接种环在酒精灯上灼烧，冷却的过程中摇匀自制酒。用接种环蘸取一环自制酒，另一只手取一个平板，将皿口掠过火焰后，打开培养皿，用蘸有自制酒的接种环在培养基上划出3条平行线，注意不要将培养基划破。再次灼烧接种环，冷却后从第一次划线的末端开始第二次划线，稀释菌液。重复四到五次，注意最后一次的划线不要与第一次相连。接种完成后在培养皿底部做好标记。 6.培养及观察 将培养皿放入28℃的恒温培养箱中倒置培养48 h。倒置培养是因为如果培养基在下面，水蒸气会凝结在皿盖上，滴下的水会破坏菌落原有的形态，影响实验结果。培养结束后观察菌落形态，记录在实验报告上。
    • 选择培养和计数
      • 选择培养基
        • 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
      • 微生物的选择培养
        • 稀释涂布平板法
      • 微生物的数量测定
        • 1.配制培养基 0.7 g磷酸二氢钾、1.05 g磷酸氢二钠、0.1 g硫酸镁、5 g葡萄糖、2 mL0.2%酚红溶液、7.5 g琼脂放入1 L烧杯中加水煮沸，溶解后加水定容至500 mL，倒入锥形瓶中，塞上塞子。 2.灭菌 将培养基、蒸馏水瓶、培养皿、试管用旧报纸包裹起来，10 mL离心管放入铁盒中，移液器吸头装入吸头盒。将这些耗材放入高压蒸汽灭菌锅中，在加压100kPa、121℃的条件下加热15分钟灭菌。灭菌结束后将耗材取出，等待冷却。 3.制作斜面保藏培养基、倒平板 先对双手和桌面喷洒70~75%酒精消毒，待酒精挥发后点燃酒精灯。等培养基冷却到放到手背上感觉不烫的时候，在培养基中加入5 mL无菌的10%尿素溶液，摇匀后开始倒平板，至少倒4组，每组3个。 4.梯度稀释 将10g土壤加入90mL无菌水中，充分摇匀，制成10倍稀释液。用移液器向7个10 mL离心管中加入分别9 mL无菌水，并做好标记。将1 mL10倍土壤稀释液加入9 mL无菌水中，吹打混匀制成1×102倍稀释液。再吸取1 mL1×102倍稀释液加入到9 mL无菌水中，吹打混匀制成1×103稀释液，如此重复直到稀释1×106倍。 5.涂布平板法接种 用移液器分别吸取100 μL1×103、1×104、1×105和1×106倍稀释液，滴加到平板上，然后取出浸泡在酒精中的涂布器，在酒精灯上点燃、灼烧，但注意不要烧太久，不然会将涂布器烧断。将涂布器靠在培养皿的上盖内侧，使其冷却，接着把菌液均匀的涂布在培养基上，最后用火焰灼烧涂布器灭菌，待其冷却一会后放回酒精中。接着再做两个平行对照以减小计数误差，接种完后在培养皿上做好标记。 6.培养及观察 将培养皿放入37℃的恒温培养箱中倒置培养48 h。培养结束后观察培养基颜色的变化和菌落形态，记录在实验报告上。 7.数据处理及分析 因为脲酶阳性菌会分解尿素产生氨，使培养基pH上升，酚红在pH< 6.8时呈黄色pH> 8.4时红色，如果培养基上长出了培养基变红的单菌落，就是可以分解尿素的细菌。选择长有30~ 300个菌落的组别进行计数，并求出平均值，计算土壤中分解尿素的细菌的种群密度。
          • 统计结果为菌落数 血细胞计数板则是活菌数和死菌数的总和
  • 发酵工程
    • 发酵工程的基本环节
      • 菌种的选育
      • 扩大培养
      • 培养基的配制灭菌
      • 接种
      • 发酵罐内发酵
      • 分离、提纯产物
    • 应用
      • 食品工业
        • 传统的发酵食品
        • 食品添加剂
        • 生产酶制剂
      • 医药工业
      • 农牧业
        • 微生物肥料、农药、饲料
      • 其他方面
        • 解决资源短缺、环境污染等
• 细胞工程
  • 植物细胞工程
    • 基本技术
      • 植物组织培养技术
        • 定义
          • 将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术
        • 过程
          • 实验：菊花的组织培养
            • 1.外植体消毒 将采回的野菊茎段去除叶片，加入洗洁精用流水冲洗30分钟，再用稀释10倍的84消毒液浸泡30分钟，然后用凉白开漂洗备用。 2.配制培养基 将2.37 g不含蔗糖和琼脂的MS培养基粉末、15 g白砂糖、2.25 g琼脂放入1 L烧杯中加水煮沸，溶解后加水定容至500 mL。待冷却到40 ℃时，加入60 μL84消毒液，搅拌均匀后，分装到喷洒了医用酒精消毒的一次性塑料杯中，用保鲜膜和橡皮筋封口，等待凝固备用。 3.接种外植体 在操作台面和手上喷洒一些医用酒精消毒后，将处理好的野菊茎段取出放在消毒的培养皿中，用提前浸泡在酒精中的解剖刀和镊子对野菊茎段切割成具节茎段，每节1 cm。将保鲜膜揭起一角，用镊子将野菊的具节茎段的形态学下端插入到培养基中，把节露在外面。将保鲜膜复原做好标记。 4.培养与观察 把接种好的材料放在明亮的窗口附近，每隔5天观察、记录外植体的生长情况，及时清理污染苗。 5.炼苗移栽 待外植体长出3~ 4条根后，揭开保鲜膜让组培苗适应环境，2~ 3天后将组培苗移栽到土壤中。
      • 植物体细胞杂交技术
        • 定义
          • 将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术
        • 过程
          • • 去壁
              • 果胶酶、纤维素酶
            • 诱导原生质体融合
              • 物理法
                • 电融合法、差速离心法
              • 化学法
                • 聚乙二醇（PES）融合发、高Ca2+—高PH融合法等
        • 目的
          • 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
    • 应用
      • 繁殖的新途径
        • 快速繁殖
          • 组织培养
        • 作物脱毒
          • 无性繁殖的植株易将病毒传给后代，而茎尖病毒少甚至不带病毒，组织培养可筛选获得脱毒苗
      • 作物新品种的培育
        • 单倍体育种
        • 突变体的利用
          • 组织培养过程中，细胞不断增殖，易受到外界影响而产生突变
      • 细胞产物的工厂化生产
        • 在离体条件下对植物细胞或细胞团进行培养，使其合成次生代谢物
  • 动物细胞工程
    • 指从动物体中取出相关的组织，将它分散为单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
    • 动物细胞培养
      • 条件
        • 营养
          • 液体培养基
        • 无毒、无菌的环境
          • 培养液定期更换，以清除代谢产物
        • 温度、PH、渗透压
        • 气体环境
      • 过程
        • • 由于废物积累、营养缺乏以及接触抑制现象则需要传代培养
            • 进行传代培养时，贴壁细胞用胰蛋白酶处理，悬浮的细胞直接离心法收集
      • 干细胞培养及应用
        • 胚胎干细胞
          • 存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内任何类型的细胞，并进一步形成机体所有组织器官甚至个体的潜能
        • 成体干细胞
          • 成体组织或器官内的干细胞 造血干细胞、神经干细胞、精原干细胞
    • 动物细胞融合技术
      • 使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术
      • 单克隆抗体
        • • 诱导动物细胞融合的方法
            • PEG\电融合法、灭活病毒诱导法等
      • 突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
    • 动物体细胞核移植技术
      • 将动物一个细胞的细胞核移入去核卵母细胞中，是这个重新组合的细胞发育成新胚胎
      • • 采集的卵母细胞在体外培养至MII期（卵母细胞进入输卵管，并停留在第2次成熟分裂中期，此时卵母细胞又称为MII卵（Metaphase II），具备受精能力）
  • 胚胎工程
    • 定义
      • 指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎一直到雌性动物体内产生后代
    • 理论基础
      • 受精
        • 准备阶段
          • 精子获能
            • 在雌性动物的生殖道内发生相应的生理变化后才获得受精能力
          • 卵子准备
            • 在输卵管内进一步成熟，到MII期时，才具备与精子受精的能力
        • 受精阶段
          • 精子穿过卵细胞膜外的结构
          • 精子接触卵细胞膜，透明带变化，阻止后来的精子进入
          • 精子入卵后形成雄原核；卵子完成减数分裂II，释放第二极体，形成雌原核
          • 雌雄原核靠近，核膜消失
      • 胚胎早期发育
    • 技术及应用
      • 体外受精
        • • 提高动物繁殖能力
      • 胚胎移植
        • 将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术
          • 缩短繁殖周期
      • 胚胎分割
        • 采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份，经移植获得同卵双胎或多胎的技术
• 基因工程
  • 重组DNA技术的基本工具
    • 限制性内切核酸酶——分子手术刀
      • 能识别特定的DNA序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二脂键断开
        • 平末端
        • 粘性末端
    • DNA连接酶——分子缝合针
      • 将两个DNA片段连接起来的酶
        • T4DNA连接酶
          • 从T4噬菌体中分离得到，可缝合平末端和粘性末端，但连接平末端的效率较低
        • E.coliDNA连接酶
          • 从大肠杆菌中分离得到，只能连接粘性末端
    • 载体——分子运输车
      • 质粒
        • 一种裸露的、结构简单的、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状DNA分子。其上有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA插入。携带外源DNA的质粒进入细胞后，能自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
          • 具有复制起点
          • 携带易于筛选的选择标记
          • 具有多种限制酶的单一识别位点
          • 具有较小的分子质量和较高的拷贝数
          • 有安全性
      • 噬菌体
      • 动植物病毒
    • 实验：DNA的粗提取和鉴定
      • 1.研磨 用天平称取5 g的花菜花倒入研磨过滤器的套筒中，用研磨棒将套筒中的材料压实，打开研磨棒上的盖子，用量筒加入5 mL的研磨液，盖上研磨棒的盖子，将材料充分研磨。 2.提取DNA 打开盖子，用吸管将滤液吸出到试管中，加入2倍体积的无水乙醇。此时SDS和粗提取的DNA会由于溶解度降低而析出，SDS会沉在底部，DNA会先漂浮在分界处，然后聚拢浮起。用镊子将DNA夹出，放在滤纸上吸干水分。 3.DNA的鉴定 将粗提取的DNA溶于2 mL 2 mol/L的NaCl溶液中，另一支试管加入2mL 2mol/L的NaCl溶液作为对照。分别加入2mL新配制二苯胺试剂后，充分摇匀，沸水浴加热5分钟。冷却后可以观察到含有DNA的试管变为淡蓝色，对照组没有明显变化。
  • 基本操作程序
    • 目的基因的筛选与获取
      • 筛选
      • 利用PCR获取和扩增目的基因
        • PCR为聚合酶链式反应的缩写
          • 是一种在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术
        • 变性
          • 温度上升到90℃时，DNA解聚为单链
        • 复性
          • 温度下降到50℃时，引物与DNA单链结合
        • 延伸
          • 温度上升到72℃时，DNA聚合酶开始合成新的DNA链
        • 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
          • 1.配制反应体系 待PCR试剂在冰盒上溶化后，向0.2 mL中依次加入9.5 μL无菌水、1 μL正向引物、1 μL反向引物、5 μL模板DNA、2.5 μL 10×PCR Buffer、2.5 μL dNTP、2.5 μL MgCl2溶液、1 μL Taq DNA聚合酶。如果用的是5×PCR Buffer，无菌水和PCR Buffer的用量应该更改为7 μL和5 μL。最后配制成25 μL的反应体系，盖上离心管盖子，放在迷你离心机中离心几秒钟，将反应液集中在离心管底部。 2.设置PCR反应程序 把离心管放在PCR仪的加热模块上，盖上盖子，拧紧热盖。在操作界面设置5分钟95 ℃预变性，30秒95 ℃变性、45秒56 ℃引物复性、1分钟72 ℃延伸，循环30次，10分钟72 ℃补延伸（图2）。然后运行程序，开始PCR反应。 3.制作琼脂糖凝胶 在等待PCR反应的过程中，称取1 g琼脂糖粉加入盛有99 mL TAE缓冲液的锥形瓶中，封口后放入微波炉中加热，直到琼脂糖完全溶解。待冷却到不烫手后，加入10 μL10000×核酸染料，摇匀后倒入制胶模具中，插入制胶梳制作点样孔。冷却后拔出制胶梳，将制好的凝胶放入盛满TAE缓冲液的电泳槽中，点样孔靠近负极一侧。 4.电泳 PCR反应结束后，将5 μL PCR产物和1 μL载样缓冲液混合，小心的将样品加入到点样孔中，第一孔应预留出来加入已知分子大小的DNA标准参照物。完成点样后盖上电泳槽盖子，再次检查电泳槽电源正负极是否接对，凝胶方向是否正确。然后开启电源，根据每厘米电泳槽8 V设置恒压电泳。待前沿指示剂迁移到凝胶的2/3处时停止电泳。 5.观察电泳结果 取出凝胶置于紫外成像仪中观察，并拍照记录实验结果。根据标准参照物比对目的片段的大小
      • 其他方法
        • 限制性内切酶酶切产生待克隆的DNA片段
        • 人工合成DNA
        • 反转录酶酶促合成法
    • 基因表达载体的构建
    • 将目的基因导入受体细胞
      • 花粉管通道法
        • 直接将DNA溶液注入子房中
        • 将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管进入囊胚
      • 农杆菌转化法
      • 利用显微注射，将目标基因注入动物受精卵
    • 目的基因的检测与鉴定
      • 分子水平
        • 检测是否插入目标基因或是否转录出mRNA
        • 抗原抗体杂交
      • 个体生物学水平
  • 应用
    • 农牧业
      • 改良动植物品种、提高作物和畜产品的产量
    • 医药卫生
      • 对微生物或动植物细胞进行改造，使其生产药物
    • 食品工业
      • 生产食品工业用酶、氨基酸、维生素等
  • 蛋白质工程
    • 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求
      • 基因工程原则上只能生产自然界中已知的蛋白质
    • 应用
      • 研发药物
• 生物技术的安全性与伦理问题
  • 转基因产品的安全性
  • 关注生殖性克隆人
    • 我国禁止生殖性克隆人
  • 禁止生物武器