万兴脑图高中生物7生物技术与工程
导图社区 高中生物7生物技术与工程
- 相似推荐
- 大纲
生物技术与工程
发酵工程
发酵
指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程
传统发酵技术
原理
C6H12O6→酶 2C3H6O3（乳酸）+能量
乳酸菌
厌氧细菌
C6H12O6→酶 2C2H5OH（酒精）+2CO2+能量
酵母菌
单细胞真菌 兼性厌氧
C6H12O6+2O2→酶2CH3COOH(醋酸)+2H2O+2CO2+能量 C2H5OH+O2→酶CH3COOH（醋酸）+H2O+能量
醋酸菌
好氧细菌
实验：制作传统发酵食品
制作泡菜
1.配制盐溶液 将2 L水烧开，加入100 g食盐，配置成5%的盐溶液，然后晾凉备用。 2.装坛 选一个用洗洁精洗干净的气密性好的坛子，喷洒医用酒精消毒。将处理好的蔬菜和香料放入坛中，加入盐水没过蔬菜，也可以加入少量生抽和白酒调味。但不要放的太满，不然泡菜水会随着气体的产生而溢出。用pH试纸测试初始pH值，记录在实验报告上。如果想发酵快一点可以加一些泡菜水或乳酸菌菌种，在坛檐上加水封坛，盖上盖子。封坛液也可用浓盐水或油代替，减缓蒸发。 3.发酵 将坛子放在室温下发酵，每天观察泡菜水浑浊程度和pH值的变化。 4.开坛品尝 9~ 10天后，将泡菜取出，带到学校与同学分享品尝，相互评价，请做得好吃的同学分享制作经验。
整个泡菜坛子其实相当于一个选择培养基，最开始的几天蔬菜表面带有的耐盐好氧微生物在坛中大量繁殖，消耗掉了坛中氧气，产生二氧化碳形成厌氧环境。在厌氧环境中可以产生乳酸的一类细菌后程发力，产生大量乳酸
制作果酒和果醋
1.处理葡萄 将葡萄用清水洗净，除去果柄和腐烂的葡萄，放在料理机中打碎。再倒入用洗洁精洗净、医用酒精消毒的白口瓶中，盖上盖子。如果葡萄有籽，最好用手把葡萄捏破放进去，不然打碎的葡萄籽会把单宁释放到发酵液中，酒会变得很苦涩。撒一些酵母粉可以提高发酵效率。 2.发酵酒 将发酵瓶放入28℃的恒温箱中发酵，如果没有恒温箱也可以选择在气温达到20℃以上的室内。如果天气比较冷，可以放在暖气、火炉边上、或用被子包裹。每天观察记录发酵液的变化。 3.品尝酒 2~3天后就发酵成了甜酒，10天后因为酒精含量上升，导致杂质沉淀，发酵液变得澄清，葡萄酒就发酵好了。用纱布过滤掉酒糟后（酒糟不要丢弃），将酒带到学校与同学分享、品鉴，同时记得保留一部分样品存于冰箱中，用于后续的酵母菌纯培养实验。 4.发酵醋 将酒糟加水，或者将发酵好的酒加水稀释一倍后，用pH试纸检测初始pH值，接着罩上一层纱布，在30℃发酵。每天观察发酵液变化，用pH试纸检测pH值，记录在实验报告上，然后对发酵液进行搅拌通气，促进醋酸菌繁殖。加入醋曲可以提高发酵效率。 5.品尝醋 7天后，如果观察到发酵液表面长出了一层白膜，说明醋发酵好了。用纱布过滤，将醋带到学校与同学分享、品鉴，同时记得保留一部分样品存于冰箱中，用于后续的醋酸菌分离与计数实验。
微生物的培养技术
基本培养技术
培养基的配置
培养基
定义
供微生物生长繁殖的培养基质
目的
以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物
分类
液体培养基
不含凝固剂（如琼脂）
固体培养基
成分
水
碳源
氮源
无机盐
以及调节PH和氧气等
无菌技术
消毒
使用较温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物
煮沸消毒
巴氏消毒
灭菌
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
消毒和灭菌后，许多操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行
微生物的纯培养
接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物，由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物
实验：酵母菌的纯培养
1.配制培养基 将100g土豆加400 mL水煮沸20分钟，纱布过滤。再加入10 g葡萄糖、10g 琼脂，溶解后加水定容至500 mL，配制成土豆培养基。将培养基的一部分分装到用于保藏菌种的试管中，占试管体积的1/3即可（选做）。其余的倒入锥形瓶中，将试管和锥形瓶塞上塞子。 2.灭菌 将培养基、培养皿、试管用旧报纸包裹起来，移液器吸头装入吸头盒。将这些耗材放入高压蒸汽灭菌锅中，在加压100kPa、121℃的条件下加热15分钟灭菌。灭菌结束后将耗材取出，等待冷却，其中装有培养基的试管应倾斜放置，待冷却后制成斜面保藏培养基。 3.倒平板 先对双手和桌面喷洒70~75%酒精消毒，待酒精挥发后点燃酒精灯。等培养基冷却到放到手背上感觉不烫的时候，开始倒平板。用左手拿起一套培养皿，中指托住下皿，食指和大拇指扣住上盖。右手拿锥形瓶在酒精灯火焰上掠过后，用左手小拇指拔下棉塞，将瓶口和培养皿口在火焰上掠过，然后用大拇指将培养皿的上盖打开一个小口，将培养基从开口处倒入培养皿（图2）。培养基铺满培养皿底部后，再次灼烧培养皿口和锥形瓶口，合上培养皿，塞上瓶塞，将培养皿放在桌面上，接着开始倒下一个平板，至少倒3个。 4.平板划线法接种 将接种环在酒精灯上灼烧，冷却的过程中摇匀自制酒。用接种环蘸取一环自制酒，另一只手取一个平板，将皿口掠过火焰后，打开培养皿，用蘸有自制酒的接种环在培养基上划出3条平行线，注意不要将培养基划破。再次灼烧接种环，冷却后从第一次划线的末端开始第二次划线，稀释菌液。重复四到五次，注意最后一次的划线不要与第一次相连。接种完成后在培养皿底部做好标记。 6.培养及观察 将培养皿放入28℃的恒温培养箱中倒置培养48 h。倒置培养是因为如果培养基在下面，水蒸气会凝结在皿盖上，滴下的水会破坏菌落原有的形态，影响实验结果。培养结束后观察菌落形态，记录在实验报告上。
选择培养和计数
选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
微生物的选择培养
稀释涂布平板法
微生物的数量测定
1.配制培养基 0.7 g磷酸二氢钾、1.05 g磷酸氢二钠、0.1 g硫酸镁、5 g葡萄糖、2 mL0.2%酚红溶液、7.5 g琼脂放入1 L烧杯中加水煮沸，溶解后加水定容至500 mL，倒入锥形瓶中，塞上塞子。 2.灭菌 将培养基、蒸馏水瓶、培养皿、试管用旧报纸包裹起来，10 mL离心管放入铁盒中，移液器吸头装入吸头盒。将这些耗材放入高压蒸汽灭菌锅中，在加压100kPa、121℃的条件下加热15分钟灭菌。灭菌结束后将耗材取出，等待冷却。 3.制作斜面保藏培养基、倒平板 先对双手和桌面喷洒70~75%酒精消毒，待酒精挥发后点燃酒精灯。等培养基冷却到放到手背上感觉不烫的时候，在培养基中加入5 mL无菌的10%尿素溶液，摇匀后开始倒平板，至少倒4组，每组3个。 4.梯度稀释 将10g土壤加入90mL无菌水中，充分摇匀，制成10倍稀释液。用移液器向7个10 mL离心管中加入分别9 mL无菌水，并做好标记。将1 mL10倍土壤稀释液加入9 mL无菌水中，吹打混匀制成1×102倍稀释液。再吸取1 mL1×102倍稀释液加入到9 mL无菌水中，吹打混匀制成1×103稀释液，如此重复直到稀释1×106倍。 5.涂布平板法接种 用移液器分别吸取100 μL1×103、1×104、1×105和1×106倍稀释液，滴加到平板上，然后取出浸泡在酒精中的涂布器，在酒精灯上点燃、灼烧，但注意不要烧太久，不然会将涂布器烧断。将涂布器靠在培养皿的上盖内侧，使其冷却，接着把菌液均匀的涂布在培养基上，最后用火焰灼烧涂布器灭菌，待其冷却一会后放回酒精中。接着再做两个平行对照以减小计数误差，接种完后在培养皿上做好标记。 6.培养及观察 将培养皿放入37℃的恒温培养箱中倒置培养48 h。培养结束后观察培养基颜色的变化和菌落形态，记录在实验报告上。 7.数据处理及分析 因为脲酶阳性菌会分解尿素产生氨，使培养基pH上升，酚红在pH< 6.8时呈黄色pH> 8.4时红色，如果培养基上长出了培养基变红的单菌落，就是可以分解尿素的细菌。选择长有30~ 300个菌落的组别进行计数，并求出平均值，计算土壤中分解尿素的细菌的种群密度。
统计结果为菌落数 血细胞计数板则是活菌数和死菌数的总和
发酵工程
发酵工程的基本环节
菌种的选育
扩大培养
培养基的配制灭菌
接种
发酵罐内发酵
分离、提纯产物
应用
食品工业
传统的发酵食品
食品添加剂
生产酶制剂
医药工业
农牧业
微生物肥料、农药、饲料
其他方面
解决资源短缺、环境污染等
细胞工程
植物细胞工程
基本技术
植物组织培养技术
定义
将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术
过程
实验：菊花的组织培养
1.外植体消毒 将采回的野菊茎段去除叶片，加入洗洁精用流水冲洗30分钟，再用稀释10倍的84消毒液浸泡30分钟，然后用凉白开漂洗备用。 2.配制培养基 将2.37 g不含蔗糖和琼脂的MS培养基粉末、15 g白砂糖、2.25 g琼脂放入1 L烧杯中加水煮沸，溶解后加水定容至500 mL。待冷却到40 ℃时，加入60 μL84消毒液，搅拌均匀后，分装到喷洒了医用酒精消毒的一次性塑料杯中，用保鲜膜和橡皮筋封口，等待凝固备用。 3.接种外植体 在操作台面和手上喷洒一些医用酒精消毒后，将处理好的野菊茎段取出放在消毒的培养皿中，用提前浸泡在酒精中的解剖刀和镊子对野菊茎段切割成具节茎段，每节1 cm。将保鲜膜揭起一角，用镊子将野菊的具节茎段的形态学下端插入到培养基中，把节露在外面。将保鲜膜复原做好标记。 4.培养与观察 把接种好的材料放在明亮的窗口附近，每隔5天观察、记录外植体的生长情况，及时清理污染苗。 5.炼苗移栽 待外植体长出3~ 4条根后，揭开保鲜膜让组培苗适应环境，2~ 3天后将组培苗移栽到土壤中。
植物体细胞杂交技术
定义
将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术
过程
去壁
果胶酶、纤维素酶
诱导原生质体融合
物理法
电融合法、差速离心法
化学法
聚乙二醇（PES）融合发、高Ca2+—高PH融合法等
目的
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
应用
繁殖的新途径
快速繁殖
组织培养
作物脱毒
无性繁殖的植株易将病毒传给后代，而茎尖病毒少甚至不带病毒，组织培养可筛选获得脱毒苗
作物新品种的培育
单倍体育种
突变体的利用
组织培养过程中，细胞不断增殖，易受到外界影响而产生突变
细胞产物的工厂化生产
在离体条件下对植物细胞或细胞团进行培养，使其合成次生代谢物
动物细胞工程
指从动物体中取出相关的组织，将它分散为单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
动物细胞培养
条件
营养
液体培养基
无毒、无菌的环境
培养液定期更换，以清除代谢产物
温度、PH、渗透压
气体环境
过程
由于废物积累、营养缺乏以及接触抑制现象则需要传代培养
进行传代培养时，贴壁细胞用胰蛋白酶处理，悬浮的细胞直接离心法收集
干细胞培养及应用
胚胎干细胞
存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内任何类型的细胞，并进一步形成机体所有组织器官甚至个体的潜能
成体干细胞
成体组织或器官内的干细胞 造血干细胞、神经干细胞、精原干细胞
动物细胞融合技术
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术
单克隆抗体
诱导动物细胞融合的方法
PEG\电融合法、灭活病毒诱导法等
突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
动物体细胞核移植技术
将动物一个细胞的细胞核移入去核卵母细胞中，是这个重新组合的细胞发育成新胚胎
采集的卵母细胞在体外培养至MII期（卵母细胞进入输卵管，并停留在第2次成熟分裂中期，此时卵母细胞又称为MII卵（Metaphase II），具备受精能力）
胚胎工程
定义
指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎一直到雌性动物体内产生后代
理论基础
受精
准备阶段
精子获能
在雌性动物的生殖道内发生相应的生理变化后才获得受精能力
卵子准备
在输卵管内进一步成熟，到MII期时，才具备与精子受精的能力
受精阶段
精子穿过卵细胞膜外的结构
精子接触卵细胞膜，透明带变化，阻止后来的精子进入
精子入卵后形成雄原核；卵子完成减数分裂II，释放第二极体，形成雌原核
雌雄原核靠近，核膜消失
胚胎早期发育
技术及应用
体外受精
提高动物繁殖能力
胚胎移植
将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术
缩短繁殖周期
胚胎分割
采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份，经移植获得同卵双胎或多胎的技术
基因工程
重组DNA技术的基本工具
限制性内切核酸酶——分子手术刀
能识别特定的DNA序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二脂键断开
平末端
粘性末端
DNA连接酶——分子缝合针
将两个DNA片段连接起来的酶
T4DNA连接酶
从T4噬菌体中分离得到，可缝合平末端和粘性末端，但连接平末端的效率较低
E.coliDNA连接酶
从大肠杆菌中分离得到，只能连接粘性末端
载体——分子运输车
质粒
一种裸露的、结构简单的、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状DNA分子。其上有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA插入。携带外源DNA的质粒进入细胞后，能自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
具有复制起点
携带易于筛选的选择标记
具有多种限制酶的单一识别位点
具有较小的分子质量和较高的拷贝数
有安全性
噬菌体
动植物病毒
实验：DNA的粗提取和鉴定
1.研磨 用天平称取5 g的花菜花倒入研磨过滤器的套筒中，用研磨棒将套筒中的材料压实，打开研磨棒上的盖子，用量筒加入5 mL的研磨液，盖上研磨棒的盖子，将材料充分研磨。 2.提取DNA 打开盖子，用吸管将滤液吸出到试管中，加入2倍体积的无水乙醇。此时SDS和粗提取的DNA会由于溶解度降低而析出，SDS会沉在底部，DNA会先漂浮在分界处，然后聚拢浮起。用镊子将DNA夹出，放在滤纸上吸干水分。 3.DNA的鉴定 将粗提取的DNA溶于2 mL 2 mol/L的NaCl溶液中，另一支试管加入2mL 2mol/L的NaCl溶液作为对照。分别加入2mL新配制二苯胺试剂后，充分摇匀，沸水浴加热5分钟。冷却后可以观察到含有DNA的试管变为淡蓝色，对照组没有明显变化。
基本操作程序
目的基因的筛选与获取
筛选
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR为聚合酶链式反应的缩写
是一种在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术
变性
温度上升到90℃时，DNA解聚为单链
复性
温度下降到50℃时，引物与DNA单链结合
延伸
温度上升到72℃时，DNA聚合酶开始合成新的DNA链
实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.配制反应体系 待PCR试剂在冰盒上溶化后，向0.2 mL中依次加入9.5 μL无菌水、1 μL正向引物、1 μL反向引物、5 μL模板DNA、2.5 μL 10×PCR Buffer、2.5 μL dNTP、2.5 μL MgCl2溶液、1 μL Taq DNA聚合酶。如果用的是5×PCR Buffer，无菌水和PCR Buffer的用量应该更改为7 μL和5 μL。最后配制成25 μL的反应体系，盖上离心管盖子，放在迷你离心机中离心几秒钟，将反应液集中在离心管底部。 2.设置PCR反应程序 把离心管放在PCR仪的加热模块上，盖上盖子，拧紧热盖。在操作界面设置5分钟95 ℃预变性，30秒95 ℃变性、45秒56 ℃引物复性、1分钟72 ℃延伸，循环30次，10分钟72 ℃补延伸（图2）。然后运行程序，开始PCR反应。 3.制作琼脂糖凝胶 在等待PCR反应的过程中，称取1 g琼脂糖粉加入盛有99 mL TAE缓冲液的锥形瓶中，封口后放入微波炉中加热，直到琼脂糖完全溶解。待冷却到不烫手后，加入10 μL10000×核酸染料，摇匀后倒入制胶模具中，插入制胶梳制作点样孔。冷却后拔出制胶梳，将制好的凝胶放入盛满TAE缓冲液的电泳槽中，点样孔靠近负极一侧。 4.电泳 PCR反应结束后，将5 μL PCR产物和1 μL载样缓冲液混合，小心的将样品加入到点样孔中，第一孔应预留出来加入已知分子大小的DNA标准参照物。完成点样后盖上电泳槽盖子，再次检查电泳槽电源正负极是否接对，凝胶方向是否正确。然后开启电源，根据每厘米电泳槽8 V设置恒压电泳。待前沿指示剂迁移到凝胶的2/3处时停止电泳。 5.观察电泳结果 取出凝胶置于紫外成像仪中观察，并拍照记录实验结果。根据标准参照物比对目的片段的大小
其他方法
限制性内切酶酶切产生待克隆的DNA片段
人工合成DNA
反转录酶酶促合成法
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
花粉管通道法
直接将DNA溶液注入子房中
将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管进入囊胚
农杆菌转化法
利用显微注射，将目标基因注入动物受精卵
目的基因的检测与鉴定
分子水平
检测是否插入目标基因或是否转录出mRNA
抗原抗体杂交
个体生物学水平
应用
农牧业
改良动植物品种、提高作物和畜产品的产量
医药卫生
对微生物或动植物细胞进行改造，使其生产药物
食品工业
生产食品工业用酶、氨基酸、维生素等
蛋白质工程
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求
基因工程原则上只能生产自然界中已知的蛋白质
应用
研发药物
生物技术的安全性与伦理问题
转基因产品的安全性
关注生殖性克隆人
我国禁止生殖性克隆人
禁止生物武器