第六章 2.目的基因制备[分子生物学]

第六章 2.目的基因制备[分子生物学]

目的基因制备

• 聚合酶链反应，PCR
  • 反应体系：待扩增DNA、引物、四种dNTP、TaqDNA聚合酶（耐热的DNA指导的DNA聚合酶，有5'-3'聚合酶活性和5'-3'外切酶活性，无校对功能）、适合的缓冲体系
  • PCR循环：95°左右，DNA双螺旋氢键断裂，形成ssDNA；温度降至Tm值或以下，引物与模板互补区结合；72°左右，TaqDNA聚合酶催化新生DNA链合成。
  • 关键
    • 模板：DNA、或者RNA的cDNA，纯化并有一定量
    • 引物
      • 应有两条引物链，3'端和5'端引物链，反应扩增的是两条引物之间的双链DNA序列。
  • 成功要素
    • 一定量一定纯度的模板
    • 一对Tm值接近的特异性引物，要控制二聚体。
  • 巢式PCR：设计两队引物进行两轮PCR扩增，外侧引物和内侧引物
• 逆转录PCR，RT-PCR
  • 概念：是将RNA逆转录为cDNA再进行PCR扩增的技术，可用于制备真核基因、构建cDNA文库，分析真核基因的表达水平
  • cDNA合成-引物决定扩增对象
    • 基因特异引物GSP：逆转录目标mRNA
    • Oligo（dT）：逆转录所有成熟mRNA
    • 随即引物：逆转录所有RNA
  • 实时荧光定量PCR
    • 概念：利用荧光信号的变化，实时监测PCR扩增反应中每次循环扩增量的变化，从而对样品中起始模板拷贝数进行定量分析。
    • 分类
      • 荧光染料嵌入法
      • 探针法：TaqMan探针=荧光报告基团+目的基因的互补序列+荧光淬灭基团
• cDNA文库
  • 概念：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA，经反转录为cDNA后，再重组和增值得到的分子克隆的总和。
• 固相化学反应
  • 亚磷酸三脂法：适合于合成引物，探针，siRNA，cDNA