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第四篇 分子医学专题
生物化学与分子生物学，第四篇 分子医学专题，被篇所涉及的理论知识是理解疾病状态下机体的生物化学与分子生物学变化的重要基础
编辑于2022-12-13 17:11:02 浙江省- 第九版
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第四篇 分子医学专题
第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用
第一节 分子杂交与印迹技术
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交：在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂交双链
（一）印迹技术
利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一既是类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术
（二）用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核酸链称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹：用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析
（二）RNA印迹：用于RNA的定性定量分析
（三）蛋白质的印迹：用于蛋白质定性定量及相关作用研究
第二节 PCR技术的原理与应用
一、PCR技术的工原理
PCR技术原理图
PCR的基本反应步骤
1）变性：将反应体系加热到94℃，使模板DNA完全变形为单链，同时引物自身及引物之间存在的局部双链也得以消除
2）退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA结合
3）延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应
4）上述3个步骤为一个循环，锌合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的
PCR体系基本组成成分
模板DNA
特异性引物
耐热DNA聚合酶
dNTPs
Mg2+
二、PCR技术的主要用途
（一）目的基因克隆
（二）基因的体外突变
（三）DNA和RNA的微量分析
（四）DNA序列测定
（五）基因突变分析
三、几种重要的PCR衍生技术
（一）逆转录PCR技术
逆转录PCR是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术
（二）原位PCR技术
原位PCR是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在
（三）实时PCR技术
实时PCR技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR
非探针类
探针类
1.TaqMan探针法
2.分子信标探针法
3.FRET探针法
第三节 基因文库
基因库：是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体
一、基因组DNA文库
基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（*包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体
二、cDNA文库
cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息
第四节 生物芯片技术
一、基因芯片
基因芯片：是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦称作DNA微阵列
二、蛋白质芯片
蛋白质芯片：是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定量和定性分析
第五节 生物大分子相互作用研究技术
一、蛋白质相互作用研究技术
（一）标签蛋白沉淀
标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。主要用于证明两种蛋白分子是否存在物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相集合的未知分子
（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途
证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测
分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基
将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质
二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术
（一）电泳迁移率变动测定
最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用
（二）染色质免疫沉淀法
是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法
第二十一章 DNA重组及重组DNA技术
第一节 自然界的DNA重组和基因转移
一、同源重组是最基本的DNA重组方式
发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换
Holliday模型的4个关键步骤
1、两个同源染色体DNA排列整体
2、一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体
3、通过分支移动产生异源双链DNA
4、Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA
片段重组体
切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA
拼接重组体
切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA
二、位点特异重组是发生在特异位点间的DNA整合
位点特异重组是由整合催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合
（一）λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特意地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列
（二）细菌的特异位点重组
鼠伤寒沙门杆菌中，hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组（倒位）。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2heeH1基因表达，反向时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因
三、转座重组可使基因移位
大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些禁言可以从一个位置移动到另一个位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子
由插入序列和转座子介导的基因移位或重拍称为转座
四、原核细胞可通过结合、转化和转导进行基因转移或重组
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用
质粒：细菌染色体外的小型环状双链DNA分子
（二）转化作用
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细获得新的遗传表型，称为转化作用
（三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用
第二节 重组DNA技术
重组DNA技术，又称分子克隆或DNA克隆或基因工程技术
主要过程包括：在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝
一、重组DNA技术中常用的工具酶
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列，并裂解磷酸二酯键
同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同粘性末端称为配伍末端
同裂酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些，酶称同裂酶或同功异源酶
二、重组DNA技术中常用的载体
载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子
克隆载体
为使插入的外源DNA序列被扩增而特异设计的载体
1.克隆载体应具备的基本特点
1）至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增
2）至少有一个选择标志：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的的，包括抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因、营养缺陷耐受基因等
3）有适宜的RE的单一切点：载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，可供外源基因插入时选着，叫多克隆位点
2.常用的克隆载体
（1）质粒
质粒：主要存在于细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的DNA分子，通常为环状双链的超螺旋结构
特点：宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状
（2）噬菌体
（3）其他克隆载体
表达载体
为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特异设计的载体
原核表达载体
真核表达载体
三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤
（一）目的基因的分类获取--分
1.化学合成法
2.从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA
3.PCR法
4.其他方法
（二）载体的选择与构建--选
目的
1.获得某一目的基因或DNA片段
2.获得目的DNA片段所编码的蛋白质
（三）目的DNA与载体连接--接
1.黏端连接
（1）单一相同黏端连接
（2）不同黏端连接
（3）通过其他措施产生黏端进行连接
1）人工接头连接：由平端加上新的酶切位点，再用限制酶除产生粘性末端，而进行黏端连接
2）同聚物加尾连接：在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造粘性末端，再进行黏端连接
3）PCR法
2.平端连接
适用于
限制性内切酶切割产生的平端
粘端补齐或切平形成的平端
3.粘-平末端连接
是指目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接
（四）重组DNA转入受体细胞---转
受体菌条件
安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态
导入方式
转化
转染
感染
（五）重组体的筛选与鉴定---筛
1.借助载体上的遗传标志进行筛选
（1）利用抗生素抗性标志筛选
（2）利用基因的插入失活/插入表达特性筛选
（3）利用标志补救筛选
（4）利用噬菌体的包装特性进行筛选
2.序列特异性筛选
（1）RE酶切法
（2）PCR法
（3）核酸杂交法
（4）DNA测序法
3.亲和筛选法
（六）克隆基因的表达
1.原核表达体系
标准
选择标志、强启动子、翻译调控序列、多接头克隆位点
E.coli表达体系的不足
不宜表达真核基因组DNA
不能加工表达的真核蛋白质
表达的蛋白质常形成不溶性包涵体
很难表达大量可溶性蛋白
2.真核表达体系
优点
可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA
可适当修饰表达的蛋白质
表达产物分区域积累
缺点
操作技术难、费时、经济
转染--将表达载体导入真核细胞的过程
磷酸钙转染
DEAE葡聚糖介导转染
电穿孔
脂质体转染
显微注射
第三节 重组DNA技术在医学中的应用
一、重组DNA技术广泛应用于生物制药
二、重组DNA技术还应用于医学的其他诸多方面
第二十二章 基因结构与功能分析技术
第一节 基因结构分析技术
一、基因一级结构解析技术
基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解析一节结构最精确的技术就是DNA测序
（一）双脱氧法和化学降解法是两种常规的DNA测序方法
Sanger双脱氧测序
Maxam-Gilbert化学降解测序法
（二）全自动激光荧光DNA测序技术的原理基于Sanger双脱氧法
1、四色荧光法
采用四种不同的荧光染料标记同一引物或4中不同的终止底物ddNTP，最终结果均相当于赋予DNA片段4中不同的颜色。因此，一个样品的4个反应产物可在同一个泳道内电泳
2、单色荧光法
采用单一荧光染料标记引物5'-端或dNTP，所有产物的5'-末端均带上了同一种荧光标记，一个样本的四个反应必须分别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳
（三）焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷酸的测序技术
（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术
循环芯片测序
优势
可实现大规模并进行分析
不需电泳，设备易于微型化
样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本
基本流程
1）将基因组DNA随机切割成为小片段
2）在所有小片段DNA分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库
3）将带接头的单链小片段DNA文库固定于固定表面
4）对固定片段进行克隆扩增，从而制成polpny芯片
5）针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列
（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术
通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术；利用DNA聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现单分子测序；直接读取单分子DNA序列信息
二、基因转录起点分析技术
（一）用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS
（二）用5'-cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS
（三）用数据库搜索TSS
三、基因启动子结构分析技术
（一）用PCR结合测序技术分析启动子结构
（二）用核酸-蛋白质相互作用技术分析启动子结构
1.用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点
足迹法是利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域，它是研究核酸-蛋白质相互作用的方法，而不是专门用于研究启动子结构的方法
（1）用核酸酶进行足迹分析
是利用DNA酶处理DNA-蛋白质复合物，然后通过电泳分析蛋白质结合序列
（2）用化学试剂进行足迹分析
是利用能切断DNA骨架的化学试剂处理DNA-蛋白质复合物，由于化学试剂无法接近结合了蛋白质的DNA区域，因此在电泳上形成空白区域的位置就是DNA结合蛋白质的结合位点。
2.用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子
（三）用生物信息学预测启动子
1.用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子
2.预测启动子的其他结构特征
四、基因编码序列分析技术
（一）用cDNA文库分析基因编码序列
（二）用RNA剪切分析法确定基因边牧序列
（三）用数据库分析基因编码序列
五、基因拷贝数分析技术
第二节 基因表达产物分析技术
一、通过检查RNA而在转录水平分析基因表达
（一）用核酸杂交法检测RNA表达水平
1.用RNA印迹分析RNA表达
2.用核糖核酸酶保护实验分析RNA水平及其剪接情况
3.用原位杂交进行RNA区域定位
（二）用PCR技术检测RNA表达水平
1.用逆转录PCR进行RNA的半定量分析
2.用实时定量PCR进行RNA的定量分析
（三）用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平
1.基因芯片已经成为基因表达谱分析的常用方法
2.用循环芯片测序技术分析基因表达谱
二、通过检测蛋白质/多肽而翻译水平分析基因表达
（一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽
（二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽
（三）用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达 的蛋白质/多肽
（四）用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞
（五）用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质/多肽表达水平
1.用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱
2.用双向电泳分析蛋白质/多肽表达谱
第三节 基因的生物学功能鉴定技术
一、用功能获得策略鉴定基因功能
本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能
（一）用转基因技术获得基因功能
转基因技术
是指将外源基因导入受精卵或胚胎肝细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或胚胎干细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代
转基因动物
是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等
（二）用基因敲入技术获得基因的功能
基因敲入
是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用
二、用功能失活策略鉴定基因功能
本质是将细胞或个体的某一基因功能部分或全部失活后，通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能
（一）用基因敲除技术使基因功能完全缺失
基因敲除
属于基因打靶技术的一种，其利用同源重组的原理，在胚胎干细胞中定点破坏内院基因，然后利用胚胎干细胞发育的全能型，获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体
（二）用基因沉默技术可使基因功能部分缺失
1.用RNA干扰技术研究基因功能
2.用miRNA技术研究基因功能
3.反义RNA技术研究基因功能
4.核酶技术
三、用随机突变筛选策略鉴定基因功能
第二十三章 癌基因、肿瘤抑制基因与生长因子
第一节 癌细胞
一、癌基因的基本概念
（一）细胞癌基因
癌基因是基因组内正常存在的基因，其编码产物通常作为正调控信号，促进细胞的增殖和生长
特点
广泛存在于生物界
基因序列高度保守
表达产物对细胞正常生长、繁殖、发育和分化起着精确的调控作用
基因结构发生异常或表达失控，导致细胞生长增殖和分化异常
（二）病毒癌基因
二、癌基因活化的机制
（一）获得启动子与增强子
逆转录病毒感染细胞后，病毒基因所携带的长末端重复序列插入到细胞原癌基因附近或内部，启动下游邻近基因的转录和影响附近结构基因的转录水平，使原癌基因过度表达或有不表达变为表达，从而导致细胞发生癌变
（二）染色体易位
在染色体易位的过程中发生了某些基因的易位和重排，使原来无活性的原癌基因移至强的启动子或增强子附近而被活化，原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生
（三）基因扩增
原癌基因可通过基因拷贝数可升高几十甚至上千倍不等，发生扩增的机制目前尚不清楚。基因扩增可致编码产物过量表达，细胞发生转化
（四）点突变
原癌基因在射线或化学致癌剂作用下，发生单个碱基的替换--点突变 ，从而改变了表达蛋白的氨基酸组成，造成蛋白质结构的变异
三、癌基因的产物与功能
（一）细胞外生长因子
作用于细胞膜上的受体系统或直接被传递至细胞内，通过蛋白激酶活化转录因子，引发一系列基因的转录激活
sis表达蛋白P28和PDGF一样能促进血管的生长
（二）跨膜的生长因子受体
接受细胞外的生长信号并将其传入胞内。受体的胞质结构区具有特异的蛋白激酶活性，通过磷酸化作用使其结构发生改变，增加激酶对底物的活性，促进生长信号在胞内的传递
c-srs、cabl有络氨酸特异的蛋白激酶活性
c-mos和raf所编码的激酶使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化
（三）细胞内信号传导分子
原癌基因的产物作为胞内信息传递体系成员，或者通过影响第二信使作用，将接受到的信号由胞内传至核内，促进细胞生长
非受体酪氨酸激酶（src，abl）、丝氨酸/苏氨酸激酶（raf），ras蛋白（H-ras，K-ras和N-ras）及磷脂酶（crk产物）
（四）核内转录因子
某些癌基因表达蛋白定位于细胞核内，与靶基因的顺式调控元件相结合直接调节靶基因的转录活性
c-fos是一种即刻早期反应基因。作为传递信息的第三信使
四、癌基因表达产物促进肿瘤发生发展
（一）BRAF
原癌基因BRAF所编码的蛋白质属于丝/苏氨酸激酶，是MAPK信号通路的重要组成分子，在调控细胞增殖、分化等方面发挥重要作用
（二）HER2
HER2是表皮生长因子受体家族成员，具有蛋白酪氨酸激酶活性，能激活下游信号通过，从而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡
（三）BCR-ABL
慢性粒细胞白血病患者的9号染色体与22号染色体之间发生易位，从而融合产生了癌基因BCR-ABL编码的蛋白质Bcr-Abl具有持续活化的蛋白酪氨酸激酶活性，能促进细胞增殖，并增加基因组的不稳定性
第二节 肿瘤抑制基因
肿瘤抑制基因概念
也称抗癌基因或抑癌基因，是调节细胞正常生长和增殖的基因。当这些基因不能表达，或者当它们的产物失去活性时，细胞就会异常生长和增殖，最终导致细胞癌变。反之，若导入或激活它则可抑制细胞的恶性表型
一、肿瘤抑制基因的发现
二、肿瘤抑制基因功能
三、肿瘤抑制基因失活促进肿瘤发生发展
（一）视网膜母细胞基因（Rb基因）
（二）TP53
（三）PTEN
四、肿瘤抑制基因与疾病
五、癌基因与肿瘤抑制基因在肿瘤发生中的作用特点
（一）细胞癌变的多基因协同
（二）细胞周期和细胞凋亡的分子调控是肿瘤进展的关键
第三节 生长因子
生长因子
一类由细胞分泌的、类似于激素的信号分子，多数为肽类（含蛋白类）物质，具有调节细胞生长与分化的作用
作用模式
内分泌
旁分泌
自分泌
一、生长因子的分类和功能
（一）生长因子的分类
（二）生长因子的功能
生长因子的生物学效应主要表现在促进细胞生长、分化、促进个体发育等方面。但是有些生长因子具有双重调节作用或负调节作用
同一生长因子对不同细胞的作用有所不同
一种细胞也可受不同生长因子调节
具有负调节作用的生长因子比较少，人们通常把这种负调节因子称为细胞生长抑制因子
二、生长因子作用机制
三、生长因子与疾病
（一)生长因子与肿瘤
（二）生长因子与心血管疾病
1.原发性高血压
myc、fos的激活促平滑肌细胞增生
p53低表达或突变
2.动脉粥样硬化
PDGF过量产生
3.心肌肥厚
ras、myb、myc、fos等过量表达，有关的生长因子有IGF、TGF、FGF
第二十四章 疾病相关基因的鉴定与基因功能研究
疾病相关基因
治病基因
一种疾病的表型和一个基因型呈直接对应的因果关系，即该基因结构或表达的异常是导致该病发生的直接原因
疾病易感基因
环境因素和遗传因素均起着一定作用，表现为2个以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因间的相互作用，而单一基因变异仅增加对疾病的易感性
第一节 鉴定疾病相关基因的原则
一、鉴定疾病相关基因的关键是确定疾病和基因间的实质联系
正确的诊断是鉴定疾病基因的先决条件
二、鉴定克隆疾病相关基因需要多学科多途径的综合策略
三、确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方法的交汇
第二节 疾病相关基因克隆的策略和方法
一、不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略
（一）从已知蛋白质的功能和结构出发克隆疾病基因
功能克隆采用的是从蛋白质到DNA的研究路线，针对的是一些对影响疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病
1、依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆疾病相关基因
2、用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因
（二）从疾病的表型差异出发发现疾病相关基因
表型克隆基于对疾病表型和基因结构或基因表达的特征联系已经有所认识的基础上来分离鉴定疾病相关基因
（三）采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因
二、定位克隆是鉴定疾病相关基因的经典方法
定位克隆仅根据疾病基因在染色体上的大体位置，鉴定克隆疾病相关基因
（一）基因定位的方法
1、体细胞杂交法通过融合细胞的筛查定位基因
2、染色体原位杂交是在细胞水平定位基因的常用方法
3、染色体异常有时可提供疾病基因定位的替代方法
4、连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法
（二）定位克隆的基本程序包括三大步骤
1、尽可能缩小染色体的候选区域
2、构建目的区域的物理图谱
3、疾病相关基因的确定
（三）假肥大型肌营养不良基因的克隆是定位克隆的成功例证
三、确定常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序
四、生物信息数据库贮藏丰富的疾病相关基因信息
第三节 疾病相关基因的功能研究
一、基因比对及功能诠释
二、利用工程细胞研究基因功能
（一）采用基因重组技术建立基因高表达工程细胞系
（二）基因沉默技术抑制特异基因的表达
三、研究生物大分子间的相互作用可确定基因功能
四、利用基因修饰动物整体研究基因功能
第二十五章 基因诊断和基因治疗
第一节 基因诊断
基因诊断的定义
是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法
基因诊断的优势
1、可在源头上识别基因正常与否，属于“病因诊断”
2、针对特定基因，特异性强
3、所用的PCR等技术具有放大效应，各灵敏度高
4、适用性强，诊断范围广
一、基因诊断的主要对象和样品来源
对象：主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可定量检测RNA和蛋白质等分子
样品来源：临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液
二、基因诊断技术
分类
定性分析
基因分析
检测基因突变
定量分析
测定基因拷贝数
测定基因表达产物量
基本流程：核酸抽提、目的序列的扩增、分子杂交、信号检测
基因诊断的基础
核酸分子杂交
DNA序列分析技术
几种技术联合使用
（一）基因缺失或插入的诊断
1、DNA印迹法
可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺失或插入片段大小等信息
2、PCR法
（二）基因点突变的诊断
1、等位基因特异性寡核苷酸分子杂交
2、反向点杂交
3、变性高效液相色谱
4、DNA序列分析
三、基因诊断的医学应用
（一）遗传性疾病诊断和风险预测
（二）多基因常见病的预测性诊断
（三）传染病病原体检测
（四）疗效评价和用药指导
（五）DNA指纹鉴定是法医学个体识别的核心技术
第二节 基因治疗
基因治疗的定义
是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换治病基因的治疗方法
一、基因治疗的基本策略
（一）缺陷基因精确的原位修复
基因矫正
基因置换
（二）基因增补
不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的
（三）基因沉默或失活
有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，可降解相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的
二、基因治疗的基本程序
（一）选择治疗基因
（二）选择携带治疗基因的载体
病毒载体
1、逆转录病毒载体
优点：转移效率高、细胞宿主范围广、DNA整合效率高
缺点
有感染性病毒的可能
增加了肿瘤发生机会
2、腺病毒载体
优点
安全性高
转染率高
范围广
缺点
基因组较大，构建复杂
不能长期表达
免疫原性较强，易被排斥
非病毒载体
（三）选择基因治疗的靶细胞
1、造血干细胞
造血干细胞是骨髓中具有高度自我更新能量的细胞，能进一步分化为其他血细胞，并能保持基因组DNA的稳定
2、皮肤成纤维细胞
具有易采集、在在体外扩增培养、易于移植等优点
3、肌细胞
肌细胞有特殊的T管系统利于注射的质粒DNA经内吞作用进入。环状质粒不整合入基因组DNA，能在肌细胞内较长时间保留
（四）将治疗基因导入人体
基因递送
间接体内治疗
将需要接受基因的靶细胞从体内取出，在体外培养，将携带有治疗基因的载体导入细胞内，筛选出接受了治疗基因的细胞，繁殖扩大后再回输体内，使治疗基因在体内表达相应产物
直接体内治疗
将外源基因直接注入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达
基因导入细胞
生物学法
病毒载体所介导的基因导入，是通过病毒感染细胞实现的，其特点是基因转移效率高，但安全问题需要重视
非生物学法
用物理或化学法，将治疗基因表达载体导入细胞内或直接道日人体内，操作简单、安全，但是转移效率低
（五）治疗基因表达的检测
三、基因治疗的临床应用现状
1、单基因遗传病的基因治疗
2、针对多基因病的基因治疗
第二十六章 组学与医学
第一节 基因组学
基因组
一个细胞（或病毒）所载的全部遗传信息，它代表一种生物所具有的全部遗传信息。对真核生物体而言，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）及线粒体或叶绿体DNA的全部序列，既有编码序列，也有大量存在的非编码序列
一、基因组学包含结构基因助学、功能基因组学和比较基因组学
基因组学
是阐明整个基因组的结构、结构与功能关系以及基因之间相互作用的科学
结构基因组学：整个基因组的遗传制图、物理制图及DNA测序
功能基因组学：认识、分析整个基因组所包含的基因、非基因序列及其功能
比较基因组学：比较不同物种的整个基因组，增强对各个基因组功能及发育相关性的认识
二、结构基因组学的主要任务是基因组作图和大规模测序
（一）遗传作图和物理作图是绘制人类基因组草图的重要策略
1、遗传作图就是绘制连锁图
遗传图又称连锁图，就是确定连锁的遗传标志位点在一条染色体上的排列顺序以及它们之间的相对遗传距离
2、物理作图就是描绘杂交图、限制性酶切图和克隆系图
（二）通过BAC克隆系、鸟枪法等完成大规模DNA测序
1、BAC克隆系的构建是大规模DNA测序的基础
2、鸟枪法是大规模DNA测序的重要方法
3、高通量测序技术大大加快了基因组DNA测序进度
（三）生物信息是预测基因组结构和功能的重要手段
三、功能基因组学系统探讨基因的活动规律
（一）通过全基因组扫描鉴定DNA序列中的基因
（二）通过BLAST等程序搜索同源基因
（三）通过实验设计验证基因功能
（四）通过转录组和蛋白质组描述基因表达模式
第二节 转录组学
转录组
指生命单元（通常是一种细胞）所能转录出来的可直接参与蛋白质翻译的mRNA中和，而其他所有非编码RNA均可归为RNA组
转录组学
是在整体水平上研究细胞编码基因转录情况及转录调控规律的科学
一、转录组学研究全部mRNA的表达及功能
转录组学就是要阐明生物体或细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA及其功能
二、RNA组学研究非编码RNA的集合
第三节 蛋白质组学
以细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用于联系，并在整体水平上研究蛋白质调控的活动规律，故又称全景式蛋白质表达谱分析
一、蛋白质组蹙额研究细胞内所有蛋白质的组成及其活动规律
（一）蛋白质鉴定是蛋白质组学的基本任务
（二）翻译后修饰的鉴定有助于蛋白质功能的阐明
（三）蛋白质功能确定是蛋白质组学的根本目的
二、二维电泳和质谱是蛋白质组学研究的常规技术
（一）二维电泳是分离蛋白质组的有效方法
（二）质谱技术是蛋白质组鉴定的重要工具
1、用肽质量指纹图谱鉴定蛋白质
2、用串联质谱鉴定蛋白质
三、蛋白质相互作用研究是认识蛋白质功能的重要内容
第四节 代谢组学
代谢组学
就是测定一个生物/细胞中所有的小分子组成，描绘其动态变化规律，建立系统代谢图谱，并确定这些变化与生物过程的联系
一、代谢组学的任务是分析生物/细胞代谢产物的全貌
二、核磁共振、色谱及质谱是代谢组学的主要分析工具
三、代谢组学数据依赖模式识别技术进行分析
第五节 其他组学
一、糖组学研究生命体聚糖多样性及其生物学功能
糖组学侧重于糖链组成及其功能的研究，其主要研究对象为聚糖，具体内容包括研究糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互作用
（一）糖组学分为结构糖组学与功能糖组学两个分支
（二）色谱分离/质谱鉴定和糖微陈列技术是糖组学研究的主要技术
（三）糖组学与肿瘤的关系密切
二、脂组学揭示生命体脂质多样性及其代谢调控
脂组学就是对生物样本中脂质进行全面系统的分析，从而揭示其在生命活动和疾病中发挥的作用
（一）脂组学是代谢组学的一个分支
（二）脂组学研究的三大步骤
1、样品分离
2、脂质鉴定
3、数据库检索
（三）脂组学促进脂质生物标志物的发现和疾病诊断
第六节 组学在医学上的应用
一、疾病基因组学阐明疾病发病机制
（一）定位克隆技术是发现和鉴定疾病基因的重要手段
（二）SNPs是疾病易感性的重要遗传学基础
二、药物基因组学揭示遗传变异对药物效能和毒性的影响
（一）药物基因组学预测药物反应性并指导个体化用药
（二）基因多态性是药物基因组学的基础和重要研究内容
（三）鉴定基因序列的变异是药物基因组学的主要研究策略
三、蛋白质组学发现和鉴别药物新靶点
（一）疾病相关蛋白质组学的研究是发现和验证药物新靶点的有效途径
（二）耐药病原体的蛋白质组学研究将为新的契机
（三）信号传导分子和途径是药物设计的合理靶点
四、代谢组学是开展预测医学和个体化医学的重要手段
（一）代谢组学丰富了预测医学的内涵
（二）代谢组学促进了个体化医学的发展