分子生物学的研究方法

从生物组织细胞提取全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体就称为基因组DNA文库。

分子生物学的研究方法

• 重组DNA技术
  • 操作过程（分切接转筛检）
    • 1、分离目的基因
    • 2、切割目的基因和载体
    • 3、连接目的基因和载体
    • 4、转化宿主细胞
    • 5、筛选阳性克隆
    • 6、检测目的基因表达产物
  • 工具酶
    • 限制性内切酶
      • 活性定义：在50ul的反应液中，37℃的温度条件下经1小时反应，将1ugDNA完全分解所需的酶量。
      • 特点：呈双重轴对称
      • 性质：切断识别部位或附近特点部位后，产生两种末端，平齐末端和粘性末端
      • 特殊的限制酶
        • 同裂酶
        • 同尾酶
    • 连接酶
      • 功能：只能催化双链DNA的连接，且不能催化缺少核苷酸的切口的连接
      • T4DNA连接酶：即可以催化平齐末端双链DNA分子的连接又可以催化粘性末端双链DNA分子的连接功能
      • E.coil.DNA连接酶：不可以催化平齐末端双链DNA分子的连接，可以催化粘性末端双链DNA分子的连接
    • 修饰酶
      • DNA聚合酶
      • 逆转录酶
      • 碱性磷酸酶
      • T4多核苷酸酶
  • 载体
    • 定义：是能够携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA，它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建而成
    • 具备条件
      • 能在宿主细胞中独立复制
      • 具有多种限制酶的单一切点以便外源DNA插入
      • 具有筛选标记，以区别阳性与阴性重组分子
      • 分子较小，便于体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离
    • 分类
      • 克隆载体
        • 特性：1、复制起始：在受体细胞中独立复制 2、多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 3、多选择标记：抗药性，其他遗传标记 4、分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大
        • 概念：以繁殖为目的的载体，通常分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。例如pBR322、pUC、M13等
      • 表达载体
        • 概念：以获得基因表达为目的的载体，通常具备强启动子、结构稳定、拷贝数高、能在宿主细胞中高效表达等特点
      • 穿梭载体
        • 概念：带有两种复制位点，在原核细胞和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真核基因的克隆
      • 人工染色体载体
• 基因克隆
  • 构建cDNA文库（DNA来源：就真核生物而言，表达特定基因的细胞或组织的mRNA群体）
    • 提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的额载体连接后转化受体菌，则每个细菌含一段cDNA并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库
    • 构建过程：
      • 1、分离有目的基因表达的组织或细胞
      • 2、制备总RNA和分离纯化mRNA
        • 方法：异硫氰酸胍法、一步热酚法
        • 关键：抑制RNAse活性
      • 3、合成cDNA第一条链
        • 条件
          • 模板（mRNA）
          • 引物
          • 逆转录酶
          • 底物（dNTP）
          • buffer（Mg+）
      • 4、合成cDNA第二条链
        • 方法
          • 自身引导法
          • 置换合成法
          • 引物－衔接头法
      • 5、双链cDNA的修饰
        • 甲基化
        • 加入接头
      • 6、双链cDNA的克隆
        • 1、同聚物加尾法
        • 2、接头－衔接头发
        • 3、mRNA－cDNA克隆法
        • 4、Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA
      • 7、cDNA文库的扩增、鉴定与评价
        • 1、核酸杂交
        • 2、特异性免疫学检测
        • 3、cDNA克隆的确证
  • 构建基因组文库（DNA来源：目的物种的基因组DNA）
    • 从生物组织细胞提取全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体就称为基因组DNA文库。
  • 3’－RACE技术
    • 1、以TotalRNA为模板，使用3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA.
    • 2、使用上游外侧特异性引物（GSP1）和3’RACE Outer Primer进行1stPCR反应。如果1stPCR反应未能得到目的产物，再使用上游内测特异性引物（GSP2）和3’RACEinnerPrimer
    • 3、PCR产物可以直接进行DNA测序或TA克隆。如果使用含有BamHI酶切位点的上游内测特异性引物进行2nd PCR扩增时，可以使用限制酶对PCR产物进行酶切反应，然后克隆至相关的载体中
  • 几种常见PCR技术
    • RT－PCR（逆转录PCR）：由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
    • qPCR（实时荧光定量PCR）：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
  • 受体细胞
    • 融合系统和融合蛋白
      • 优点：防止表达产物被水解、可分泌到体外
      • 缺点：目的蛋白的分离纯化较麻烦
    • 瞬时表达系统和稳定表达系统
      • 瞬时表达系统：进入宿主的目的DNA没有和宿主DNA整合，随着细胞生长，宿主内目的基因的数量递减直至消失，表达过程只能持续数天。
      • 稳定表达系统：进入宿主的目的DNA整合宿主染色体DNA中稳定遗传
  • 基因导入技术
    • 氧化钙导入法
      • 1、制备感受态细胞
        • 感受态：细胞容易吸收DNA分子的能力
      • 2、转化处理
    • 电穿孔法
      • 原理：细胞膜主要成分是磷脂双分子层，外加电场作用，膜两侧电位差增大，膜变的不稳定而产生孔隙，使得大小分子可进入细胞内，但此孔隙由于外加电场的移走而得到恢复，不会给细胞致命伤害
      • 优点：转化效率高
  • 重组体的筛选
    • 利用抗生素抗性基因筛选
      • 插入失活法
        • 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外源片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。
      • 直接筛选法
        • 插入目的基因→转化受体细胞→培养细胞→死亡（非重组体）/生长受抑制（重组体）→培养细胞
    • 利用营养缺陷互补筛选
      • 蓝白斑筛选法
        • 在载体的lacZ基因中插入外源DNA, 造成lacZ基因失活, 不能合成α-肽, 失去同宿主的互补, 不能形成有功能的β-半乳糖苷酶, 失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上, 含阳性重组体的细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体); 非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。
    • 免疫学方法原理
      • 基本原理:抗原抗体的特异性结合
      • 先决条件：重组的目的基因可以在受体细胞内表达、存在目的蛋白的抗体
    • 阳性克隆的筛选
    • 原位杂交法
      • 
    • Southern杂交法原理
      • 
• 遗传标记技术
  • SNP：指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A、T、C、G）的突变引起的多态性。
    • 基因芯片技术
      • ：是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法
      • 原理:通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有错配碱基的序列杂交。待测基因样品经PCR扩增及荧光化学标记后与固定的探针进行杂交。
  • RFLP限制性片段长度多态
  • SSR微卫星标记
• 蛋白质组学技术
  • 蛋白质纯化
    • 凝胶过滤层析
      • 分子筛效应，即按分子的大小及形状来分离样品。具体说，大分子物质由于分子直径大，难于进入凝胶颗粒的微孔，只能分布在凝胶颗粒的间隙中。随流动相向下移。动，大分子以较快的速度流过层析柱，而小分子物质能进入凝胶颗粒的微孔中，不断地进出于一个个凝胶颗粒的微孔，这样使小分子物质向下移动的速度小于大分子物质。因而，酶液中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层折柱，实现酶的分离纯化。
    • 离子交换层析
      • 蛋白质是两性电解质，不同蛋白质由于其PI不同，在同一种 pH值介质中电离状况会不同，分子所带电荷种类和数量就不同，与离子交换剂的静电吸附能力也不同。通过吸附和改变离子强度或pH值解吸洗脱，可使蛋白质依据其静电吸附能力由弱到强的顺序而分离开来。
    • 亲和层析
      • “功能性提纯”，利用生物高分子和配基之间通过某些次生键专一性相互结合，形成中间复合物的能力，即亲和力。具体说，将载体在碱性条件下用溴化氰活化，用化学方法将配基结合到某种活化固相载体上，此过程称为偶联反应。通过偶联反应制成亲和吸附剂，并装入层析柱中，然后将样品通过层析柱，使生物大分子和配基结合而被吸附在亲和吸附剂表面，而其它没有特异结合的杂蛋白可通过洗涤而流出。再用适当方法使这些生物大分子与配基分离而被洗脱下来。
    • 带his标签的重组蛋白纯化
      • His-Tag在基因5’或3’端加6个组氨酸密码子，被合成的重组蛋白会在N或C端有一个6个组氨酸的标签,它可以和带镍离子的亲和层析柱结合.便于重组蛋白的纯化。
    • 双向凝胶电泳
      • 第一向：等电聚焦：根据蛋白质等电点不同
      • 第二向：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳：依据蛋白质分子质量的不同
    • 蛋白印迹杂交技术
      • 步骤：①制备蛋白样品 ②SDS-PAGE分离样品 ③ 分离的蛋白原位印迹到膜上，封闭膜上未反应的位点，抑制抗体的非特异性吸附 ④ 固定在膜上的蛋白作抗原，与一抗结合(对应的非标记抗体) ⑤ 洗去游离一抗，加入二抗(酶偶联或放射性同位素标记的)，通过显色或放射自显影公检测凝胶中的 蛋白成分
• 融合系统：目的基因插入宿主某蛋白质的基因中形成的表达系统 融合蛋白：融合系统表达的目的基因产物的N端和宿主的蛋白质杂合在一起形成融合蛋白