生物氧化

生物化学的生物氧化部分，包括生物氧化的特性、呼吸链、氧化磷酸化以及质子梯度产生的机制。

生物氧化

• 生物氧化的特性
  • 生物氧化：指糖、脂肪、蛋白质等有机物质在活细胞内氧化分解，产生CO2和H2O并释放能量的作用称为生物氧化。
  • 生物氧化与非生物氧化的共同点：（1）反应的本质都是脱氢、失电子或加氧；（2）被氧化的物质相同，终产物和释放的能量也相同。
  • 生物氧化与非生物氧化的主要差别：（1）生物氧化的主要方式为脱氢；（2）生物氧化在酶的催化下进行，因此条件比较温和；（3）生物氧化是在一系列酶、辅酶和电子传递体的作用下逐步进行的，每一步释放一部分能量；（4）在氧化过程中释放的能量一般都贮存在一些特殊的化合物中，主要是ATP分子。
  • 生物氧化主要包括三方面内容
    • 细胞在酶的催化下将有机化合物中的C变成CO2-CO2
      • 基本方法：底物脱羧基作用
    • 细胞在酶的催化下利用分子氧将有机化合物中的H氧化成H2O- H2O
      • 电子传递过程：分解代谢形成的还原型辅酶通过电子传递途径重新氧化。还原型辅酶上的氢原子以质子形式脱下，其电子沿着一系列的电子载体转移，最后转移到分子氧。质子和离子化的氧结合形成水。
    • 当有机物被氧化成CO2和H2O时，释放的能量转化成ATP
      • 底物水平磷酸化、氧化磷酸化、光合磷酸化
• 呼吸链
  • 定义：生物氧化过程中，从代谢物脱下来的氢和电子需要经过一系列中间传递体，最后才传给末端的电子受体，在其间能量逐步释放。这种由一系列电子传递体构成的链状复合体称为电子传递系统（ETS）或简称为呼吸链。
    • 呼吸链的位置：原核细胞——细胞膜；真核细胞——线粒体内膜
  • 主要成员
    • 1.烟酰胺腺嘌呤核苷酸（NAD）或称辅酶І
    • 2.黄素蛋白
    • 3.铁硫蛋白：分子量较小的、含有Fe和S的蛋白质。
    • 4.辅酶Q（泛醌）
      • 是脂溶性醌类化合物，由多个异戊二烯连接形成较长的疏水侧链，而且分子较小，可在线粒体内膜的磷脂双分子层的疏水区自由扩散。哺乳动物含有十个异戊二烯单位，所以简称Q10。
      • 在电子传递链中处于中心地位。是和复合体I和复合体II结合不紧密的辅酶，可以在线粒体内膜内部迅速扩散，在复合体I，II和III作为一种灵活的电子载体。
      • 氧化型和还原型两种形式互相转变CoQ的得失电子既可以分两步进行，也可以一步到位，同时得失两个电子。
    • 5.细胞色素
      • 是一类含有血红素辅基的蛋白质、借助铁的价态变化来传递电子。它们在还原状态下，通常α、β、γ三个吸收峰，其中α吸收峰的差别最大。根据此吸收峰的波长，分为三大类，即细胞色素a、b、c（Cyta、Cytb、Cytc）。
      • a类细胞色素可进一步分为细胞色素a和细胞色素a3, b类细胞色素可进一步分为细胞色素b562（bL）和细胞色素b566 （bH）, c类细胞色素可进一步分为细胞色素c和细胞色素c1，只有细胞色素C是可溶的，充当流动的电子传递体。
    • 6.氧气：是所有有氧生物呼吸链的末端电子受体，1分子氧可以接受4个电子，被还原成氧负离子。
  • 呼吸链组分的排列顺序
    • 测定各成分的标准氧化还原电位（EΘ＇）
      • EΘ＇值表示一种物质的氧化还原能力，即得失电子的能力。EΘ＇值越小，其还原性越强，更容易失去电子而被氧化；EΘ＇值越大，其氧化性越强，更容易得到电子而被还原。
        • 呼吸链中各种组分的排列顺序应当由低EΘ＇依次向高EΘ＇排列。
    • 根据在有氧环境下氧化反应达到平衡时各电子传递体的还原程度来确定
    • 使用特异性呼吸链抑制剂和人工电子受体
      • 使用位点特异性抑制剂，可在特定位置阻断呼吸链，经过一定时间以后，在被阻断部位的上游，各个传递体应为还原型，而下游一侧的应为氧化型。
    • 呼吸链的拆分和重组
      • 将呼吸链拆分成四种具有不同催化活性的复合体（复合体I~IV）以及游离的CoQ和细胞色素c。
      • 电子传递链的种类
        • NADH呼吸链电子传递方向：复合体I→CoQ→复合体Ⅲ→细胞色素c→复合体IV→O2
        • FADH2呼吸链电子传递方向：复合体Ⅱ→CoQ→复合体Ⅲ→细胞色素c→复合体IV→O2
        • 1个NADH经过呼吸链产生2.5个ATP，1个FADH经过呼吸链产生1.5个ATP。
  • 复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的结构和功能
    • 复合体I（即NADH-CoQ氧化还原酶）
      • 成分： NADH还原酶，辅基：FMN和铁硫蛋白 功能： 接受来自NADH的e-， NADH只能参与双电子转移反应。2e- 转移导致4质子泵入到膜间隙。
    • 复合体Ⅱ（即琥珀酸-CoQ氧化还原酶）
      • 成分：琥珀酸脱氢酶 辅基：铁硫蛋白、细胞色素b560。电子传递不产生跨膜质子梯度。
    • 复合体Ⅲ（即CoQ-细胞色素c氧化还原酶）
      • 成分： Fe-S蛋白、细胞色素b和c1 功能：电子来自CoQH2，最后传给细胞色素c。一对电子可产生4个质子梯度。
    • 复合体IV（即细胞色素c氧化酶）
      • 组成：有4个氧还中心、细胞色素a和a3、两个铜离子CuA和CuB 功能：一对电子可产生2个质子梯度。
  • 呼吸体
    • 多年来，人们一直以为，构成呼吸链的各复合体作为独立的结构和功能单位存在于脂双层膜上，但是许多细胞在需要的时候，相邻的复合体可结合在一起形成更大的超级复合，如I/Ⅲ、I/Ⅲ/Ⅳ和Ⅲ/Ⅳ，而其中具有完整呼吸活性的呼吸链超级复合物又被称为呼吸体。 在哺乳动物中,最为常见的呼吸体由复合体Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ按照1:2:1比例组装而成（Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1）。
• 氧化磷酸化
  • 定义：呼吸链的主要功能是产生能量货币ATP。当电子沿着呼吸链向下游传递的时候总伴随着自由能的释放，释放的自由能有很大一部分用来驱动ATP的合成，这种与电子传递相偶联的合成ATP的方式被称为氧化磷酸化。
  • 化学渗透学说
    • 该学说由Peter Mitchell于1961年提出，可以用来解释氧化磷酸化的偶联机制。
    • 核心内容：电子在沿着呼吸链向下游传递的时候，释放的自由能转化为跨线粒体内膜（真核生物）或跨质膜（细菌和古菌）的质子梯度，随后质子梯度中蕴藏的电化学势能被直接用来驱动ATP的合成。驱动ATP合成的质子梯度通常被称为质子驱动力（PMF），它由化学势能（质子的浓度差，ΔpH）和电势能（内负外正，ΔΨ）两部分组成。
      • 电子经呼吸链传递时，可将质子(H+)从线粒体内 膜的基质侧泵到膜间隙，产生膜内外质子电化学 梯度，储存能量。 当质子顺浓度梯度回流时驱动ADP与Pi生成ATP。
    • 实验证据
      • (1)氧化磷酸化的进行需要完整的线粒体内膜的存在。
      • (2)使用精确的pH计可以检测到跨线粒体内膜两侧质子梯度的存在。据测定，一个呼吸活跃的线粒体膜间隙的pH要比其基质的pH低0.75个单位，内膜两侧的电位差约为0.15~0.2V。
      • (3)破坏质子梯度的化学试剂能够抑制ATP的合成。例如，缬氨霉素是一种K+的载体,能够将细胞质基质中的K+带入线粒体基质，抵消质子驱动力中的电势能，从而抑制ATP的合成；再如，解偶联剂可直接破坏质子梯度，导致氧化磷酸化受到抑制。
      • (4)人工建立的跨线粒体内膜的质子梯度也可驱动ATP的合成。不管是通过改变pH建立起来的质子梯度，还是通过菌紫红质建立起来的质子梯度，都可以被膜上的F1F0-ATP合酶利用而合成ATP。
      • (5)从线粒体内膜纯化到的一种酶，能够直接利用质子梯度合成ATP，此酶称为F1F0-ATP酶。
        • F1F0-ATP合酶的结构
          • F1：亲水部分，水溶性的球状蛋白质，线粒体内膜的基质侧，催化ATP合成（α3β3γδε）。 F0：疏水部分：镶嵌在线粒体内膜中，形成跨内膜质子通道 。（ab2C10-14） F0和F1之间通过柄连接。寡霉素(oligomycin)和二环己基碳二亚胺(DCCD)能够直接作用于F0而抑制ATP的合成。
        • F1F0-ATP合酶的催化机制
          • 结合变构学说
            • 1977年Paul D. Boyer提出的结合变构( binding change)学说能正确地解释F1F0-AT合酶的作用机理。
            • 核心内容：质子与F0的结合，可改变F1的构象，而F1构象的变化使其能够不断地合成ATP并将合成好的ATP释放出来。
            • 详细内容
              • (1)在活性中心合成ATP并不需要质子驱动力,与活性中心结合的ATP或ADP处于平衡。
              • (2)合成好的ATP离开活性中心却是需要能量的。因此,如果没有质子流过F0，与活性中心结合的ATP就不会与酶解离。
              • (3)3个β亚基(β1、β2和β3)因为与γ亚基的不同部位结合，所以采取不同的构象。1个β亚基为紧密的构象，即T态；1个β亚基为松散的构象，即L态； 1个β亚基为开放的构象，即O态（位于C端的螺旋-转角-螺旋的模体结构上，使得这个β亚基能释放出结合的核苷酸而处于O态）。
              • (4)L态：与底物结合松弛, 能结合ADP+Pi；T态：紧密结合,具催化能力,ATP合成；O态：开放形式底物亲和力极低，ATP释放。
              • (5)三种状态的β亚基可以相互转变,转变过程由γ亚基的转动所驱动。γ亚基转动的动力来自于质子通过F0的流动。每消耗3个质子，γ亚基转动120°，其中有一个β亚基合成并释放出1个ATP。γ亚基转动一圈，即360°，需要消耗9个质子，这时三个β亚基各合成并释放出了一个ATP。
            • 结合变构学说可简化为：质子流动→驱动C单位转动→带动γ亚基转动→诱导β亚基构象变化→ATP释放和重新合成。
  • 氧化磷酸化的抑制
    • 1.呼吸链位点特异性抑制剂
      • 作用机制：通过抑制呼吸链上的电子传递，阻止质子梯度的生成而间接抑制氧化磷酸化。实例：鱼藤酮、抗霉素A、CO、氰化物、H2S或叠氮化物等。
    • 2.F1F0-ATP合酶特异性抑制剂
      • 作用机制：直接作用于F1F0-ATP合酶而导致ATP不能合成。实例：寡霉素(oligomycin)和二环己基碳二亚胺(DCCD)能够直接作用于F0而抑制ATP的合成。
    • 3.解偶联剂
      • 作用机制：能够快速地消耗跨膜的质子梯度，使得质子难以通过F0F1-ATP合酶上的质子通道合成ATP，从而将贮存在质子梯度之中的电化学势能全部变成了热能。此外，随着质子梯度的消失，电子在呼吸链上的“回流”压力将会减轻，进而可使细胞内脂肪和糖类等物质的氧化更加旺盛。也正因为如此，有的解偶联剂曾被用作减肥药。
      • 两类解偶联剂： 有机小分子化合物：通常为脂溶性的质子载体，带有酸性基团。 天然的解偶联蛋白（UCP）：UCP在线粒体内膜上形成质子通道，使质子流发生“短路”，不通过F1F0-ATP合酶就返回到线粒体基质。至少已发现5种类型的UCP(UCP1-UCP5)。UCP1 又名产热素：它主要存在于动物的褐色脂肪组织，与机体的非颤抖性产热有关。UCP2存在于多数细胞，UCP3 主要存在于骨骼肌，UCP4 和UCP5存在于脑。它们都是受到高度调控的蛋白质，一旦激活，都能增加热量产出。
    • 4.ATP/ADP交换体的特异性抑制剂
      • 作用机制：通过抑制线粒体内外ATP/ADP的交换而间接抑制氧化磷酸化。 实例：苍术苷和米酵菌酸。
  • 氧化磷酸化的调节
    • 呼吸控制：氧化磷酸化对电子传递的一种反馈,即由ADP作为关键物质对氧化隣酸化的调节。当线粒体内ADP浓度↑，F1F0-ATP合酶活性↑，质子梯度↓，电子传递速率↑，耗氧率↑， 细胞呼吸↑；当线粒体内ADP浓度↓，F1F0-ATP合酶活性↓，质子梯度↑，电子传递速率↓，耗氧率↓，细胞呼吸↓。
    • 共价修饰调节：已发现呼吸链上的多种蛋白质可以发生磷酸化修饰，这些修饰可以影响到氧化磷酸化。复合体Ⅳ就可以受到PKA的催化发生磷酸化，而它的脱磷酸化由一种受Ca2+激活的蛋白质磷酸酶催化。
    • 甲状腺素调节：甲状腺素T3，可刺激UCP2和UCP3的表达，这两种解偶联蛋白可以让质子流短路，从而减 少ATP的产生。而T2可以在线粒体基质一侧与复合体Ⅳ结合，使其产生质子梯度的效率降低，这也减少了ATP的产生。
• 质子梯度产生机制
  • Q循环
    • Q循环最先由Mitchell提出，由两个半循环组成。复合体Ⅲ使用Q循环。
    • 在第一个半循环中，1个流动到内膜P侧的QH2将1个电子经铁硫蛋白和细胞色素c1交给细胞色素c，同时将2个质子释放到膜间隙，第2个电子经细胞色素bL和bH被交回到N侧的氧化型Q而生成Q-·。 在第二个半循环中，另外一个QH2以同样的方式将1个电子经铁硫蛋白和细胞色素c1交给细胞色素c，同时将2个质子释放到膜间隙，第2个电子经细胞色素bL和bH被交给第一个半循环中生成的Q-·并结合基质内的2个质子，再生成还原型的QH2，并进入下一轮环。
  • 分子蒸汽机
    • 该机制是由Rouslon G. Efremov等人在2010年提出的“分子蒸汽机“模型。复合体I使用分子蒸汽机机制产生质子梯度。释放出的能量驱动两个主要结构域在界面上发生显著的构象变化。该构象变化会带动一段长α螺旋发生一种活塞氏的运动，而让临近三段不连续的跨膜螺旋倾斜，由此改变由它们组成的3个质子通道内可解离基团的性质，进而导致3个质子移位，而第4个质子则在两个结构域之间发生移位。
• P/O值是指电子传递过程中，每消耗1摩尔氧原子所消耗的无机磷酸的摩尔数。P/O值越高，氧化磷酸化的效率就越高。 1对电子经过NADH呼吸链或FADH2呼吸链传给O2，分别产生10个H+和6个H+梯度。产生的ATP数目是不一样的，两条呼吸链的P/O值也就不同。ATP 离开，ADP进入线粒体，通过ATP-ADP 转位酶 每1个ATP的输出消耗1个H+ 每1个ATP合成大概需要消耗3 H+ 于是，合成及加上输出 1 ATP = 4H+
• 质子是通过与各个c亚基上的酸性氨基酸（Asp或Glu）残基可逆结合和解离进行。人的c亚基：由两个跨膜的α螺旋组成。第二个跨膜螺旋上的Glu59。