离子交换层析

蛋白质纯化-离子交换层析基础知识思维导图，包括：原理、固定相结合条件、洗脱条件、操作步骤。

离子交换层析

• 原理
  • 离子交换层析是基于带相反电荷分子间相互吸引力，蛋白质表面所带电荷取决于其pI和环境pH
  • 阳离子交换剂带负电，阴离子交换剂带正电
    • 大于pI时，蛋白质带负电荷，可与阴离子交换剂结合
    • 小于pI时，蛋白质带正电荷，可与阳离子交换剂结合
  • 蛋白质的保留时间和盐浓度决定了其与基质表面相互作用的结合位点数量，一般在低盐浓度浓度时使蛋白质结合，而在高浓度时洗脱蛋白质。等度洗脱窗口很低，因此通常以线性盐浓度梯度洗脱蛋白质。
• 固定相
  • 常用固定相
    • 多糖：纤维素，葡聚糖和琼脂糖
    • 合成有机聚合物：聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酸酯，聚苯乙烯
    • 无机材料：二氧化硅，羟基磷石灰
• 结合条件
  • 离子交换剂推荐盐浓度为10~100mmol/L的缓冲液，电导率相应为1~4mS/cm
  • 来源于细菌培养物的一般性原料或细胞培养物，其电导率一般为15~40mS/cm。这样得到蛋白质溶液必须进行稀释或脱盐处理
  • 最大上样体积为层析柱总体积1/3
  • 蛋白质结合的原则
    • 根据蛋白质等电点选择缓冲液种类
    • 选择缓冲液的pKa应该接近于所选pH，最多只能有1个单位pH左右差别
    • 缓冲液本身不能与离子交换剂结合，如乙酸盐或Tris。不应将乙酸盐用于阴离子交换层析，Tris也不能用于阳离子交换层析，若缓冲液与交换剂结合，可引起pH不稳定，操作条件具有不可重复性
    • 当蛋白质接近离子交换剂表面，可能会暴露于不同的pH
• 洗脱条件
  • 洗脱方式
    • 线性盐梯度
    • 分步盐梯度
    • pH梯度
    • 置换展开
      • 常用于分离性质相关蛋白质
  • 蛋白质的滞留窗口一般很小，在较低的盐浓度条件下，蛋白质填料结合紧密，但随着盐浓度提高，不能完全保持结合状态
• 操作步骤
  • 加载盐溶液
    • 平衡离子必须要彻底地饱和带点荷的配基
    • 通常采用含有1mol/L的NaCl，物质的量浓度为10~100mmol/L的缓冲液进行，避免使用二价离子
    • 体积应至少为1个柱体积，确保层析柱饱和
  • 平衡层析柱
    • 才用的缓冲液应适宜与蛋白质结合
    • 平衡过程应至少需要10个柱体积缓冲液，为了获得更稳定的pH环境
  • 蛋白质上样
    • 应采用与平衡缓冲液一致的pH和电导率，由于原料离子组成与缓冲液完全不同，很难做到
  • 洗去未结合物质
    • 为了在洗脱中获得目标蛋白质纯度更高，可以采用多步洗脱程序
    • 可以向冲洗缓冲液中加入某些化合物，而所加入的这些化合物似乎很具有蛋白质特异性，这些物质可以是尿素，糖类，乙二醇等
  • 洗脱
    • 一般最好先采用线性的盐梯度洗脱，维持梯度约10个柱体积
      • 最简单情况下，梯度操作需要两种缓冲液，平衡缓冲液A和用于加载相反电荷离子作用的缓冲液B
      • 大多数情况洗不需要后半段的梯度，因为多数蛋白质可以在150~500nmol/L盐浓度下从传统离子交换剂上洗脱下来
      • 最大梯度达到50%B
    • 分布洗脱也是通过A和B来实现
  • 再生
    • 最佳条件是使用与最初加载盐溶液相同的缓冲液，这种情况仅在处理相对清洁的原料时才能出现
    • 当脂类，内毒素和其他粘性物质承载与离子交换柱时，推荐使用具有腐蚀性的试剂进行再生，优选1mol/L的NaOH，一般使用1个柱体积
    • 对于非常顽固的杂质，应将层析柱浸于NaOH溶液中，可将1个柱体积NaOH泵入层析柱后，停止流动，使NaOH滞留于层析柱数小时
  • 消毒处理
    • NaOH处理同样起消毒作用，它确实可以减少层析柱细菌数量，但不是对层析柱进行灭菌，一般不必对层析柱进行灭菌处理
    • 层析柱需要用再生缓冲液仔细洗净后才能储存，储存时用相反电荷离子将层析柱完全饱和，饱和后，可采用缓冲液进行清洗和储存，如20%乙醇。实验室使用时，推荐使用相关杀菌剂，如叠氮化钠