细胞增殖与凋亡检测

细胞增殖与凋亡检测的技术和原理，详细的总结了增殖，凋亡的内容。希望对各位小伙伴有所帮助哦！

细胞增殖与凋亡检测

• 增殖
  • 直接观察
    • 细胞直接计数（计数板/计数仪）
    • 有丝分裂细胞计数：HE染组织切片，通过形态判断有丝分裂数
  • DNA合成检测
    • 3H-TdR掺入法
      • 原理：3H-TdR（胸腺嘧啶核苷）为DNA合成前体，掺入DNA合成，通过放射性强弱检测增殖能力 β-液体闪烁计数仪
      • 优缺点：灵敏度高，重复性好；需要特定放射性实验室和仪器，放射性核素污染
    • BrdU
      • 原理：BrdU是胸腺嘧啶5-甲基被溴取代，可作为类似物掺入DNA合成，并且可以被BrdU专一性抗体检测
      • 优点：①非放射性；②阳性反映S期DNA合成水平，定位准确；③可体内外标记；④受细胞内外环境影响小，标记不会丢失
      • 缺点：①抗体识别需要DNA变性提供足够空间；②因而会破坏抗原识别位点，影响其他染料结合（包括全面细胞周期分析也需要结合dsDNA）；③实验时间长；④对于植物抗体检测还需消化细胞壁。
    • EdU法
      • 原理：EdU也是类似物，与荧光小分子结合发生不可逆化学反应，无需解链。荧光强度反映新合成DNA的量，从而区分细胞周期的不同阶段
      • 缺点：无需DNA变性、无需抗体和植物破壁、快速、信号更强，可细胞周期分析
  • 细胞示踪活性染料
    • CFSE
      • 原理：亲脂染料，自由进入细胞，在细胞内偶联蛋白，失去亲脂基团无法再出细胞。随细胞分裂平均分配到子代细胞中，即荧光强度为亲代一半，可根据荧光强度判断增殖细胞及其代数。绿色
      • 安全；活体标记；稳定，持续时间长；结果客观，操作简单，经济，可特定亚群跟踪
    • CTV/CMTPX
      • 与CFSE类似，分别为细胞示踪紫、示踪红
      • 相比CFSE，CTV的毒性小；CTV占据DAPI通道，因而标记细胞死活用PI
  • 细胞活力相关检测
    • MTT法
      • 原理：细胞增殖时线粒体能量代谢过程使MTT形成蓝色甲攒，量与增殖程度正相关
      • 产物需经异丙醇溶解，未溶解会造成较大误差
    • CCK8
      • 原理：类似于MTT，生成可溶的橙黄色甲攒，细胞增殖越快越多则颜色越深
      • 优点：直接检测显色，更简便；重复性优于MTT；灵敏度高
  • 增殖相关蛋白检测
    • Ki67检测
      • 原理：Ki67是核增殖标志物，只在增殖期表达(不含G0)，通过其水平反映增殖能力
      • 核蛋白，需用破细胞核膜buffer进行穿膜、检测
• 凋亡
  • 形态学
    • 光镜和倒置显微镜
      • 细胞体积变小、变形，膜完整但发泡，晚期有凋亡小题，贴壁细胞皱缩、变圆、脱落
      • 染色细胞：染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，凋亡小体（瑞氏染色成蓝色）
    • 荧光和共聚焦显微镜
      • 检测细胞核染色质形态变化，用DNA特异性染料如DAPI，凋亡细胞染色质浓缩、DNA碎片化
    • 电子显微镜
      • 凋亡I期：染色质高度盘旋，“空穴现象”空泡结构；IIa期：染色质高度凝聚、边缘化；凋亡晚期：细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体
  • DNA断裂
    • DNA片段化
      • 原理：凋亡激活核酸内切酶使凋亡细胞DNA在核小体之间规律断裂，产生挂核小体片段（约180bp的倍数），形成DNA ladder，琼脂糖电泳检测
      • 坏死细胞DNA断裂点无规律，可用此区分坏死和凋亡
    • DNA含量分析
      • 碘化丙啶PI为碱基类似物，嵌入DNA对细胞核染色。凋亡细胞DNA裂解为小片段，在细胞膜通透剂处理下小分子DNA穿过细胞丢失，仅剩大片段DNA，染色后流式检测，DNA＜2n对应的亚二倍体峰代表凋亡细胞
    • TUNEL
      • 脱氧核糖核酸末端转移酶TdT将标记的dUTP连接到DNA的3'-OH，正常细胞一条DNA条数有限只有很少的3'末端，而凋亡细胞由于DNA断裂产生大量3'末端
  • 细胞膜相关
    • Annexin V
      • 正常细胞中磷脂酰丝氨酸PS位于细胞膜内侧，凋亡早期PS外翻到细胞膜表面，Annexin V是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，高亲和结合PS
      • 优点：PS外翻早于DNA断裂，因而检测凋亡早期更灵敏；TUNEL需固定而该法不需
    • PI/7-AAD
      • 凋亡中晚期和坏死细胞的细胞膜丧失完整性，可进入细胞核结合DNA
    • Annexin V/PI(7-AAD)染色，前者单阳说明是凋亡早期，双阳晚期，双阴活细胞
  • 线粒体
    • 线粒体膜电位
      • JC-1染料在正常细胞聚集于线粒体基质，聚合物发红色荧光；凋亡细胞由于电位破坏，JC-1不能聚集，在细胞质中以单体形式存在发绿色荧光
    • 细胞色素C释放
      • 凋亡细胞色素C从线粒体内膜释放到细胞质，利用线粒体和胞质提取液分别提取两组分，利用WB检测细胞色素C存在部位
  • 分子水平
    • Caspase活性
      • WB：Caspase-3正常以酶原形式存在(32kDa)，凋亡过程中切割为p17和p12两个小片段，发挥凋亡作用，因而可用WB检测caspase3的大小判断其激活情况
      • 流式：细胞凋亡期间caspase3和7激活，切割染料CellEvent Caspase-3/7 Green中的DEVD多肽序列，致使试剂结合DNA发出荧光信号
      • 但凋亡晚期和死亡细胞，caspase3活性明显下降
    • 凋亡相关蛋白与信号通路
      • 促凋亡分子
        • Bax，Bcl-Xs，Bak，Bad，Bid，AIF，Apaf-1等
      • 抑制凋亡分子
        • Bcl-2，Bcl-XL和bcr/abl激酶等
      • 抗凋亡信号通路
        • PI3K-Akt，NIK-NFκB
      • 促凋亡信号通路
        • MKK-JNK，Fas-FADD，P53