DNA的合成

生物化学，DNA的合成、后随链：另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能随着模板链的解开，逐段地从5’—3’生成引物并复制子链。

DNA的合成

• 中心法则
• DNA复制的基本规律
  • 半保留复制
    • 亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成子链DNA双链。
    • 遗传信息的相对稳定是物种稳定的分子基础
  • 双向复制
    • 原核生物只有一个复制起点，复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制
    • 复制中的模板DNA形成2个延伸方向相反的开链区，称为复制叉
    • 真核生物为多起点双向复制
    • 从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域称为复制子
  • 半不连续复制
    • 前导链：沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的
    • 后随链：另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能随着模板链的解开，逐段地从5’—3’生成引物并复制子链
    • 冈崎片段：沿着后随链合成大的新DNA片段
  • 高保真性
    • 半保留复制
    • 严格的碱基配对原则
    • 复制叉的复杂结构
    • 核酸外切酶活性和校读功能以及复制后修复系统对错配加以纠正
  • 需引物
  • 子链合成方向5’—3’
• DNA复制的酶学和拓扑学
  • 参与DNA复制的物质要素
    • 底物：dATP、dGTP、dCTP、dTTP
    • 聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol
    • 模板：解开成单链的DNA母链
    • 引物：提供3‘-OH末端使dNTP可以依次聚合
    • 其他的酶和蛋白质因子
    • Mg2+等
  • DNA聚合酶聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合
    • 全称：依赖DNA的DNA聚合酶
    • 简称：DNA-pol
    • 活性
      • 5’—3’的聚合活性
      • 核酸外切酶活性
        • 3’—5’外切酶活性：能辨认错配的碱基对，并将其水解
        • 5’—3’外切酶活性：能切除突变的DNA片段
    • 原核生物至少有5种DNA聚合酶
      • DNA-pol Ⅰ
        • 有3’—5’核酸外切酶活性（大片段）及5’—3’核酸外切酶活性（小片段）
        • 对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补
      • DNA-pol Ⅱ
        • 有3’—5’核酸外切酶活性，无5’—3’核酸外切酶活性
        • DNA-pol Ⅱ对模板的特异性不高，参与DNA损伤的应急状态修复
      • DNA-pol Ⅲ
        • 有3’—5’核酸外切酶活性，无5’—3’核酸外切酶活性
        • DNA聚合酶Ⅲ全酶结构
          • ２个核心酶
            • α亚基
              • 合成DNA
            • ε亚基
              • 具有3’—5’核酸外切酶活性（复制保真性所必需）
            • θ亚基
              • 可能起组装作用
          • 1个γ复合物
            • 6种亚基组成：γ、δ、δ’、ψ、χ、τ
            • 功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用
          • 1对β亚基
            • 发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用
        • 是E.Coli中真正的复制酶
    • 常见的真核生物DNA聚合酶有5种
      • DNA-pol α：起始引发，有引物酶活性
      • DNA-pol β：参与低保真度的复制，DNA修复
      • DNA-pol γ：线粒体DNA合成
      • DNA-pol δ：后随链合成
      • DNA-pol ε：前导链合成
  • DNA聚合酶的碱基选择和校对功能
    • DNA复制的保真性至少要依赖三种机制:
      • 遵守严格的碱基配对规律
      • 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能
      • 复制出错时有即时的校对功能
    • 复制的保真性依赖正确的碱基选择
      • 利用“错配”实验发现，DNA pol Ⅲ对核苷酸的参入具有选择功能
      • DNA pol Ⅲ对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实现其选择功能
    • 聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正
      • 核酸外切酶是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的
  • 复制中DNA 分子拓扑学变化
    • DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。
    • 多种酶参与DNA解链和稳定单链状态
      • 解螺旋酶——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链
      • 引物酶——复制起始时催化生成RNA引物的酶
      • 单链DNA结合蛋白(SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整
    • DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口
      • DNA连接酶作用方式：连接DNA链3’-OH末端和相邻DNA链5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链
      • 功能
        • DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用
        • 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用
        • 也是基因工程的重要工具酶之一
    • DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态
      • 原核生物拓扑异构酶Ⅱ又称促旋酶
      • 拓扑异构酶分类及作用机制：
        • 拓扑异构酶Ⅰ：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当 时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP
        • 拓扑异构酶Ⅱ：切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态
      • 拓扑异构酶作用特点:
        • 既能水解 、又能连接磷酸二酯键
• 原核生物DNA复制过程
  • 复制的起始
    • 起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物
    • 需要解决的两个问题
      • DNA解开成单链，提供模板
      • 形成引发体，合成引物，提供3’-OH末端
    • DNA的解链
      • 复制有固定起点
      • DNA解链需多种蛋白质参与
      • 解链过程中需要DNA拓扑异构酶
    • 原核生物的复制起始部位及解链
    • 引物合成和起始复合物形成
      • 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶（对利福平不敏感）和DNA复制起始区域的复合结构称为起始复合物（引发体）
      • 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子
  • DNA链的延长
    • 复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成
    • 领头链的合成
      • 领头链的子链沿着5’→3’方向可以连续地延长
    • 后随链的合成
      • 沿着5’→3’方向呈不连续延长
    • 在复制叉同时合成前导链（先）和后随链（后）
  • 复制的终止：切除引物、填补空缺、连接切口
    • 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点处汇合
  • 真核生物线粒体DNA按D环方式复制
    • D-环复制是线粒体DNA的复制形式
• 真核生物DNA复制过程
  • 真核生物与原核生物DNA复制的差异：
    • 真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢，Ori C更为复杂等
    • 核小体结构的循环变化
    • DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶转换
    • 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等
    • 复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动
  • 真核生物复制的起始与原核基本相似
    • 复制的起始需要DNA-pol α（引物酶活性）、pol δ和pol ε参与。还需解螺旋酶活性、拓扑酶和复制因子(RF)
  • 真核生物复制的延长发生DNA聚合酶转换
    • 现在认为pol α主要催化合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol δ和DNA pol ε所替换，这一过程称为聚合酶转换（DNA pol α/δ）。DNA pol δ负责合成后随链，DNA pol ε负责合成前导链。
    • 前导链：出现在引发后期
    • 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际
    • 发生DNA聚合酶转换的原因是Pol α不具备持续合成能力
    • DNA聚合酶转换的关键蛋白是RFC
  • 真核生物DNA合成后立即组装成核小体
    • 阻止、干扰DNA复制进行抗菌抗肿瘤的治疗的有效靶点及药物
      • 抑制细菌的拓扑异构酶Ⅱ（旋转酶、螺旋酶）：环丙沙星
      • 抑制真核拓扑异构酶Ⅱ：依托泊苷
      • 抑制真核拓扑异构酶Ⅰ：拓扑替康、伊立替康
      • 抑制核苷酸合成的抗代谢物：6-MP、MTX、5-FU等
      • 破坏DNA模版：烷化剂（氮芥/环磷酰胺/塞替派等）
  • 端粒酶参与解决染色体末端复制问题
    • 染色体DNA呈线状，复制在末端停止
    • 复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接
    • 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙
    • 端粒
      • 重要作用：维持真核细胞染色体稳定及DNA复制的完整性
      • 线性DNA复制一次端粒缩短
      • 端粒由富含TG的重复序列组成
      • 人的端粒重复序列为5’-(TnGn)x-3’
      • 这些重复序列多为双链，但每个染色体的3’端比5’端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题
    • 端粒酶
      • 组成：
        • 端粒酶RNA (hTR)
        • 端粒酶协同蛋白( hTP1)
        • 端粒酶逆转录酶(hTRT)
      • 端粒酶是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成
      • 端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3’端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体的3’端。这些新合成的DNA为单链
      • 端粒酶的爬行移位
        • 通过延长染色体DNA末端序列并最终形成端粒，让每一次DNA复制导致的5’末端的短缩发生在端粒处，而不会损耗线性染色体DNA序列本身
      • 端粒结合蛋白（TBP）
    • 端粒与衰老、癌症等疾病
      • 端粒活性与端粒长度密切相关
        • 多数体细胞端粒酶活性较低
        • 生殖、胚胎、干细胞及淋巴细胞除外
      • 端粒缩短是衰老的主要原因之一
        • 端粒随年龄增长而逐渐缩短
        • 端粒缩短至极限时将导致早衰及死亡
• 逆转录
  • 逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制
    • 逆转录
    • 逆转录酶
    • RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因
    • cDNA
      • 试管中合成cDNA
      • 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链
      • 分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法
  • 逆转录的发现发展了中心法则
    • 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现
    • 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能
    • 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论