导图社区 DNA重组和常用技术
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常用技术/DNA重组
DNA重组
基本概念
DNA重组（DNA recombination）
是指不同DNA分子经过断裂和连接形成新DNA分子的过程
重组DNA技术（Technology of DNA recombination）
是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程
自然界的DNA重组和基因转移
一、同源重组
是最基本的DNA重组方式
发生在两个DNA分子同源序列之间的互换过程 不需要特定的DNA序列
二、位点特异性重组
由整合酶催化完成
是发生在特异位点间的DNA整合
三、转座重组
由插入序列和转座子介导的基因转移或重排
真核&原核
四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组
接合作用
是质粒DNA通过细胞间相互接触发生转移的现象
转化作用
是受体细胞自主摄取外源DNA并与之整合的现象
转导作用
是病毒将供体DNA带入受体并与之染色体发生整合的现象
重组DNA技术
主要过程
在体外将目的DNA与能自主复制的遗传元件（载体）连接，形成重组DNA分子
重组DNA分子在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得单一DNA分子的大量拷贝
组合+扩增
常用的工具酶
限制性核酸内切酶（RE）
I型、II型、III型
I型和III型酶为复合功能酶，不在所识别的位点切割DNA（即特异性不强）
II型酶能在DNA双链内部的特异位点识别并切割，故其被广泛用作“分子剪刀”
特点
大部分来自细菌（少数绿藻）限制外源DNA侵入 保护细菌基因组
识别位点通常为6或4个碱基序列 大多为回文序列
DNA连接酶
只能2断1才能相连
DNA聚合酶I
5-3聚合活性
填空
3-5外切活性
校对
5-3外切活性
去引
合成双链DNA
Klenow片段
合成cDNA第二条链/双链DNA3‘标记
逆转录酶
建立cDNA文库（目的基因库）
合成cDNA第一条链
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基团
常用的载体
载体（vector）
是为携带目的外源DNA片段、实现外源DNA在受体细胞中无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些DNA分子
按其功能可分为两类：
克隆载体
用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子。
表达载体
是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体
1.至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制
最基本特点
2.至少有一个选择标志 从而区分是否有载体的细胞
如抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等
3.有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体
举例
质粒
是细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的双链环状DNA分子
噬菌体DNA载体
λ噬菌体 M13噬菌体
携带较长外源基因
柯斯质粒载体
细菌BAC/酵母YAC人工染色体载体
依据宿主细胞分类
原核表达载体
真核表达载体
二者的区别主要在于为外源基因提供的表达元件
质粒真核表达载体的特点：
操作步骤
（一）目的DNA的分离获取（分）
化学合成法
已知目的基因所有核苷酸序列
基因组DNA文库和cDNA文库
DNA探针
PCR法
最常用 高效 仅需部分序列
酵母单杂交系统克隆DNA结合蛋白基因
酵母双杂交系统克隆特异性相互作用蛋白质的编码基因
（二）载体的选择与准备（选）
依据DNA克隆的目的
一是获取目的DNA片段
选用克隆载体
二是获取目的DNA片段所编码的蛋白质
选择表达载体
（三）目的DNA与载体连接（连）
依据目的DNA和线性化载体末端的特点
黏端连接
黏-平端连接
有方向性
平端连接
无方向性
（四）重组DNA转入受体细胞（转）
转化：
是指将外源DNA直接导入细菌、真菌的过程，受体细胞经过处理成为感受态细胞
转染：
是指将外源DNA直接导入真核细胞（酵母除外）的过程
常用磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法
感染：
是指以病毒颗粒作为外源DNA运载体导入宿主细胞的过程
如噬菌体、腺病毒、逆转录病毒等
接合：细菌通过菌毛相互接触 质粒DNA在细菌间转移
（五）重组体的筛选与鉴定（筛）
通过载体携带的选择标记或目的DNA片段的序列特征进行筛选和鉴定
分类
1. 遗传标志筛选法
抗生素抗性筛选
插入失活/插入表达筛选
利用标志补救筛选
利用噬菌体的包装特性筛选
2. 序列特异性筛选
核酸杂交法，DNA测序法、RE酶切法、PCR法
3. 亲和筛选法
重组DNA已进入宿主细胞并编码产物
抗原-抗体亲和
配体-受体亲和
（六）克隆基因的表达（表）
最终目标
原核表达体系
真核表达体系
医学中的应用
一、重组DNA技术用于生物制药
重组人胰岛素、干扰素等
重组HBV、HPV VLP疫苗
人源化单克隆抗体，如赫赛汀
二、重组DNA技术是医学研究的重要技术平台
人类疾病动物模型
遗传修饰细胞模型
发现基因新功能或新基因
三、重组DNA技术是基因及其表达产物研究的技术基础
1. 在基因组水平上干预基因
2.在RNA水平上干预基因的功能
3. 研究蛋白质的相互作用
常用技术
印迹技术
DNA印迹技术
又称 southern bloting
RNA印迹技术
又称 nouthern bloting
蛋白质印迹技术
又称 western bloting
PCR技术
步骤
①变性:将反应体系加热至95C,使模板DNA完全变性成为单链
②退火:将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA结合
③延伸:将温度升至72C ,DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合 '成反应
经多次循环 (25 ~30次)后即可达到扩增DNA片段的目的
用途
获得目的基因片段
最常用 最简便方法
DNA/RNA的微量分析
基因诊断
DNA序列分析
基因突变分析
基因体外突变
衍生技术
逆转录PCR(RT-PCR) 原位PCR 实时PCR
生物大分子相互作用
蛋白质相互作用
酵母双杂交技术/标签蛋白沉淀
DNA-蛋白质相互作用
电泳迁移率变动分析/染色质免疫沉淀
蛋白质的分离纯化 结构分析
蛋白质沉淀用于浓缩与分离
有机溶剂（丙酮 乙醇） 盐析 免疫沉淀
透析 超滤去除小分子化合物
电泳
醋酸纤维素膜 凝胶电泳
层析分离
离子交换层析（带点少的先掉下来）
凝胶过滤（大分子蛋白先掉下来）
蛋白质沉降与超速离心
密度 形态 沉降系数
结构分析
一级结构
离子交换层析 两端残基
二级结构
圆二色光谱法（α-螺旋蛋白质）
空间结构
X射线衍射 核磁共振
基因文库
概念:一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体
基因组DNA文库
以DNA片段的形式贮存着某-生物的全部基因组DNA信息
cDNA文库
包含某一组织细胞在一定条件 下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体,它以cDNA片段贮存着该组织细胞的基因表达信息
