导图社区 抗体制备
抗体制备的思维导图，内容有免疫原的制备、免疫佐剂、多克隆抗体(PcAb)的制备及应用、单克隆抗体(McAb)的制备及应用、基因工程抗体及应用
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第八章 荧光免疫试验的思维导图， 荧光免疫试验是以荧光物质标记抗体和抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术。
第六章 免疫沉淀试验的思维导图，分享了基本原理、液相免疫沉淀实验、凝胶内免疫沉淀试验、临床应用的知识，一起来看看吧。
第五章 免疫凝集实验的思维导图，内容有基本原理、直接免疫凝集试验、间接免疫凝集试验、抗人球蛋白红细胞免疫凝集试验（Coombs试验）、自身红细胞凝集试验、临床应用、常用试剂的方法特点、主要影响因素，一起来看。
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抗体制备
免疫原的制备
免疫原
能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原
分类
颗粒性抗原
包括：人或各种动物细胞的抗原、细菌抗原、寄生虫抗原
常用抗原
绵羊红细胞
10^6/ml浓度的细胞悬液
细菌抗原
菌体抗原
100℃水浴2~2.5h（杀菌并破坏鞭毛抗原）
鞭毛抗原
0.3~0.5%甲醛处理
细菌毒素抗原
杀菌后加入0.5~1%氯化钙溶液
细胞膜
寄生虫抗原
虫卵
可溶性抗原
指蛋白质（糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体和细菌外毒素）、多糖、核酸等，大多需细胞破碎后，纯化获得抗原
步骤
组织和细胞可溶性抗原的粗提
组织细胞抗原的制备
粉碎
高速组织捣碎机法
研磨法
沉淀物：组织或细胞碎片 上清液：可溶性抗原
细胞可溶性抗原的制备
超声破碎法
间歇进行
酶处理法
冻融法
表面活性剂处理法
可溶性抗原的纯化
超速离心法
根据抗原比重特点进行分离
差速离心法
低速和高速离心交替进行，用于分离大小差别较大的抗原颗粒
密度梯度离心法
利用各颗粒在梯度介质中的沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度梯度层内，达到彼此分离的目的
常用介质：蔗糖、甘油、氯化铯
选择性沉淀法
根据蛋白质理化性质的差异，采用不同的沉淀剂或改变不同的条件，促使某一蛋白抗原成分沉淀，达到纯化的目的
方法
盐析法
蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面离子及其周围水分子的数目
有机溶剂沉淀法
降低溶液的电解质常数、增加蛋白质的静电引力、破坏蛋白质水化膜
乙醇和丙酮
聚合物沉淀法
在一定的 PH 、离子强度和温度下，选择性沉淀不同分子量的蛋白质
蛋白质分子量越大，所需的聚乙二醇（ PEG ）浓度越低
聚合物：聚乙二醇（PEG）
核酸沉淀法
氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素
凝胶层析法
利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离
离子交换层析法
利用蛋白质带电荷不同进行分离
离子交换剂：离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂
亲和层析法
利用生物大分子之间具有的专一性亲和力
利用抗原抗体结合的特异性（专一性）和可逆性
免疫球蛋白片段的制备
目的
得到分辨率更高的针对小片段或单链的特异性抗体
半抗原
概念
仅有抗原性而无免疫原性的物质
如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等
载体
赋予半抗原以免疫原性的物质
免疫佐剂
预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的非特异性免疫增强性物质
提高抗原对机体的免疫原性，从而提高机体产生抗体的效价
生物性佐剂
无机化合物佐剂
人工合成佐剂
动物免疫中应用最多
弗氏佐剂（FA）
弗氏不完全佐剂
液状石蜡+羊毛脂
弗氏完全佐剂
弗氏不完全佐剂+卡介苗
佐剂与抗原：1：1混合，油包水乳化液
乳化方法
搅拌混合法
作用
增强抗原免疫原性
增强机体对抗原刺激的反应性，提高抗体的效价
促进抗体类型转换， IgM 转变为 IgG
引起或增强迟发型超敏反应
机制
改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统
刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力
刺激淋巴细胞增殖和分化
多克隆抗体(PcAb)的制备及应用
将含有多种抗原表位的抗原物质刺激机体免疫系统时，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体
免疫动物的选择
抗原来源与动物种属的关系
种属差异越远，免疫原性越强动物
动物个体的选择
适龄、健康、体重符合要求
抗原的性质
免疫程序
免疫原的剂量
中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10~20天，三次及以后间隔7~10天
免疫途径
皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结
动物采血法
颈动脉采血法
最常用
家兔．绵羊．山羊
静脉采血法
家兔．山羊、绵羊
心脏采血法
家兔、豚鼠、大鼠、鸡
抗血清的鉴定和保存
鉴定
抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法
抗体效价的鉴定：凝集试验、双向免疫扩散试验、 ELISA
抗体纯度的鉴定： SDS - PAGE 、双向免疫扩散试验、免疫电泳
抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、 ELISA 、 RIA 竞争结合试验
保存
2℃~8℃保存：短期保存
冰冻保存：保存5年
真空干燥保存：保存5~10年
抗体的纯化
特异性IgG抗体的纯化
特异性抗体纯化
吸附法
单克隆抗体（McAb）的制备及应用
由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别某一特定抗原表位的同源抗体
特点
理化性状高度均一、纯度高、特异性强、少或无交叉反应
原理
在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增值的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点 这种杂交瘤细胞作单个细胞培养后，可形成单细胞系，及单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸排列顺序、特异性等都是一致的
亲本细胞的选择和融合
小鼠骨髓瘤细胞
细胞株稳定，易于传代培养
细胞株不产生 Ig 的重链和轻链
细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤核酸核糖转换酶（ HGPRT )；胸腺嘧啶激酶（ TK ）缺陷株
能与 B 细胞融合成稳定的杂交瘤细胞
融合率高
免疫脾细胞
细胞融合
PEG：分子量4000的 PEG 是最常用的细胞融合剂
作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG ，其纯度与毒性有所不同
融合方法
骨髓瘤细胞与淋巴细胞（1:3)
50% PEG 1min内加完
2min内加10ml培养液
选择培养基的应用
HAT培养基
H:次黄嘌呤 A:氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断 DNA 合成主要途径 T:胸腺嘧啶核苷；"核苷酸前体"，供细胞通过替代途径合成 DNA
选择作用
淋巴细胞：不能生长，5-7天死亡； DNA 合成的主要途径被 A 阻断
骨髓瘤细胞：不能生长，5-7天死亡；HGPRT 缺乏， DNA 合成的替代途径受阻
杂交瘤细胞：长期生长繁殖；利用淋巴细胞的 HGPRT ，将 H 合成为票呤碱并最终与 T 一起合成 DNA ；从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力
阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
克隆方法
有限稀释法
不需任何特殊设备
克隆出现效率高
实验室常用方法方法
细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5~1个细胞
显微操作法
FACS法
效率最高 价格昂贵
软琼脂平板法
生产
动物体内诱生法
体外细胞培养法
兔单克隆抗体
纯化
最有效
Ig 类型亚类测定
表位测定
特异性测定
亲和性测定
McAb 靶抗原分子量
特性
高度特异性
高度的均一性和可重复性
弱凝集反应和不呈现沉淀反应
弱细胞毒作用
对环境敏感性
优点
在体外"永久"地存活并传代
用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的～均一的抗体．适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法
可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗
缺点
固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围
反应强度不如多克隆抗体
制备技术复杂、费时费工、价格较高
应用
检验医学诊断试剂
蛋白质的提纯
肿瘤的导向治疗
放射免疫显像技术
基因工程抗体及应用
人源化抗体
小分子抗体
双特异抗体
抗体融合蛋白
噬菌体抗体库技术
重组多克隆抗体
