核酸杂交技术

核酸杂交是指 互补的核苷酸序列（DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA等）通过Watson-Crick碱基配对形成非共价键，从而形成稳定的同源或异源双链分子的过程，称为核酸分子杂交技术，又称核酸杂交。 本图总结了相关知识。

核酸杂交技术

• 基本原理
  • 核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程。
    • DNA变性：规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构
      • 增色效应:DNA变性后对260nm紫外光收增加
        • 融解温度Tm： 在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度
    • DNA复性:变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸
      • 减色效应:变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少
• 核酸探针
  • 概念
    • 能与靶核酸序列发生碱基互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知的被标记(同位素或非同位素标记)的核酸分子。
  • 种类
    • 基因组DNA探针
      • 为某基因的全部或部分序列，或某一非编码序列——靶序列是DNA
    • cDNA探针
      • 以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链——靶序列是mRNA
    • RNA探针
      • 以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。
    • 400-500bp
    • 寡核苷酸探针
      • 17-50bp
  • 标记方法
    • 标记物的选择
      • 放射性同位素标记物
      • 非放射性同位素标记物
    • 标记方法的选择
      • 1、随机引物标记 2、DNA缺口平移标记 3、全程RNA探针标记 4、化学法全程标记 5、3'未端标记 6、5'未端标记
  • 检测方法
    • 放射性标记探针的检测
      • 放射自显影
      • 液体闪烁计数法
    • 非放射性标记探针的检测
      • 酶促显色
        • 间接检测：酶标记到亲和素、抗生物素抗体或抗地高辛抗体上 直接检测：酶直接标记到探针上
      • 荧光检测
        • 荧光直接标记到探针上，主要用于原位杂交，通过荧光显微镜观察
      • 化学发光检测
        • 酶促反应的产物，经激发光激发后发出荧光
• 经典的核酸分子杂交技术
  • 液相杂交
  • 固相杂交
    • 菌落杂交
      • 用于重组细菌克隆筛选
    • Southern印迹杂交
      • DNA/DNA杂交 印迹＋杂交
      • 用于单基因遗传病诊断、基因点突变的检测
    • Northern印迹杂交
      • 靶序列是RNA 探针可用DNA或RNA片段 待测样品为总RNA或mRNA
      • 用于RNA病毒的检测、基因表达的检测，金标准
    • 点杂交和狭缝杂交
      • 斑点印迹为圆形 狭缝印迹为线状 都能鉴别DNA、 RNA 简单、快速，同一张膜可检测多个样品 特异性不高、不能鉴别核酸分子量
    • 反向点杂交
      • 正向 固相：靶序列 液相：探针 标记：探针 一次只能检测一个未知序列 反向 固相：探针 液相：靶序列 标记：样本 一次可以检测多个未知序列
    • 原位杂交
      • 荧光原位杂交Fish
        • 用于细胞遗传学分析、比较基因组杂交、基因图谱绘制、病原学检测
• 影响杂交信号检测的因素
  • 长探针杂交的影响因素
    • 影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素
      • 核酸分子浓度与杂交速率 (低)探针和靶序列的浓度越高，杂交速度越快 (高)探针扩散速率高，杂交速度越快
        • 提高探针扩散速率的方法: 使用小片段探针 小反应体积 高反应温度 振摇
      • 高浓度双链探针 高浓度的双链探针会自身复性，尽量使用短小的单链探针
      • 碱基组成 G+C含量越高，杂交速度越快
      • 盐溶液的浓度 离子强度越高，杂交体的稳定性越高 杂交一高浓度，洗脱一低浓度
      • 温度 温度越高，杂交速度越快；温度上限=Tm-20~30℃
      • 甲醛 甲醇降低Tm 1%甲醛一Tm下降0.63度
      • 错配 错配降低杂交速度 10%错配一杂交速度下降一半
      • 加速剂
    • 酶联探针
      • 选择杂交和洗脱的条件，应考虑酶的稳定性和活性
    • 杂交反应体积
      • 体积越小，探针浓度越高；应保证滤膜被完全覆盖
    • 杂交的时间
      • 复杂程度N越大，杂交所需时间越长 探针越短，杂交所需时间越长 探针越低，杂交所需时间越长
  • 短小寡核苷酸探针的杂交
    • 影响寡核苷酸探针稳定性的因素
      • Tm Tm越高，稳定性越高
      • 盐溶液 离子强度越高，稳定性越高 高浓度-杂交 低浓度-洗脱
    • 杂交时间
      • 控制到最短
    • 杂交加速剂
    • 洗脱条件
      • 洗脱时间要短
    • 寡核苷酸杂交条件的优化
      • 高特异性
        • 杂交温度接近Tm
          • 高盐浓度(6×SSC)
        • 洗脱温度接近Tm
          • 低盐浓度(6×SSC)
      • 低特异性
        • 杂交温度接近Tm-10℃
          • 高盐浓度(6×SSC)
        • 洗脱温度接近Tm-10℃
          • 高盐浓度(6×SSC)
• 分子杂交过程
  • 预杂交 目的：减少非特异性杂交
  • 杂交 影响因素： 影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素 酶联探针 杂交反应体积 杂交时间
  • 洗脱 目的: 洗去未反应的探针 洗去与滤膜疏松结合的探针 洗去非特异性结合的探针
• DNA芯片技术