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分子生物学
分子生物学，内容有基因与基因组、基因表达调控、DNA损伤与修复的分子机制、基因结构与表达分析方法、疾病产生的分子基础、基因治疗、基因克隆与基因体外表达、基因诊断，涉及主要考点，根据思维导图背书即可~
编辑于2023-03-16 11:07:11 湖南
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分子生物学
基因与基因组
基因的分类
结构基因
非结构基因
只转录不翻译的基因：核糖体RNA基因，tRNA基因
人类基因
调节区（启动子、增强子、上游启动子元件等）
前导区
编码区（外显子、内含子）
尾部区
原核生物
基因组结构
基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成
基因组只有一个复制起点，具有操纵子结构
编码序列一般不会重叠，基因是连续的，无内含子，转录后不需要剪切
编码区在基因组中所占的比例远远大于真核基因组，但又远远小于病毒基因组，非编码区主要是主要是一些调控序列
基因组重复序列很少。编码蛋白质的结构基因多为单拷贝，但编码rRNA的基因往往是多拷贝的 这有利于核桃里的快速组装
编码序列一般不会重叠
具有编码同工酶的同基因
细菌基因组中存在着可移动的DNA包括插入序列和转座子
在DNA分子中具有多种功能的识别区域，如复制起始区、复制终止区、转录启动区和终止区等
在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止序列，使转录终止和RNA酶脱落
质粒分类
按功能：
F质粒，R质粒，Col质粒
按复制机制
严紧型质粒
松弛型质粒
按质粒转移方式
接合型质粒
可移动型质粒
自传递型质粒
质粒特性
能在细胞内自主复制，但不同质粒对数宿主细胞的复制系统利用程度不同，许多质粒的复制是自主调节的，不受染色体复制调节因素的影响
细胞分裂时恒定地传给子代
质粒的不相容性：具有相同复制系统的质粒不能共存于同一细胞内。不相容性使质粒能够很容易被克隆
质粒的转移性：有些质粒可以通过细菌接合作用在细菌细胞间传递
转位因子
插入序列IS
转座酶基因
两侧的反向重复序列
转座子Tn
转座酶基因
其他基因
两侧的反向重复序列
可转座的噬菌体
一类具有转座功能的溶源性噬菌体，包括Mu和D108等
转座作用的机制
简单转座（单纯转座）
复制性转座
真核生物基因组
结构特点
真核细胞基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内
真核细胞的基因转录产物为单顺反子，及一个结构基因转录/翻译成一个mRNA,一条多肽链
存在大量重复序列
基因组中不编码的区域多与编码区域
基因是不连续的（外显子与内含子）
具有许多复制起点，而每个复制子的长度较短
按分类
高度重复序列10^6
反向重复序列
两个相同序列的互补拷贝在同一条DNA上反向排列而成
卫星DNA
重复单位成串排列
功能
参与复制水平的调节
参与基因表达的调控
参与转位作用
与进化有关
同一种属中不同个体的高度重复序列的重复次数不同，可以作为个体特征（DNA指纹）
α卫星DNA成簇分布在染色体着丝粒附近，可能与染色体减数分裂时染色体配对有关
中度重复序列10--10^5
Alu家族
KpnⅠ家族
Hinf家族
多聚dT -dG家族
rRNA家族
单拷贝序列（低度重复序列）
多基因家族
由某个祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因
假基因
线粒体基因
tRNA基因
rRNA基因
细胞色素氧化酶基因
ATP酶基因
细胞色素还原酶基因等
真核与原核的比较
病毒基因组一般结构特点
病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小，但是不同的病毒之间其基因组相差亦甚大。
乳头瘤病毒：闭环的双链DNA
腺病毒：线性双链DNA
脊髓灰质炎病毒：单链RNA
呼肠弧病毒：双链RNA，10个片段
流感病毒：RNA，8个片段
病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成，每种病毒颗粒中只含有一种核酸，或为DNA或为RNA，两者一般不共存于同一病毒颗粒中。组成病毒基因组的DNA和RNA可以是单链的，也可以是双链的，可以是闭环分子，也可以是线性分子。
噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒有的基因是间断的，具有内含子，除了正链RNA病毒之外，真核细胞病毒的基因都是先转录成mRNA前体，再经加工才能切除内含子成为成熟的mRNA。有些真核病毒的内含子或其中的一部分，对某一个基因来说是内含子，而对另一个基因却是外显子
有的RNA病毒基因组由不连续的RNA链组成。未发现有节段性的DNA分子构成的病毒基因组。
病毒基因组的功能单位或转录单位可被一起转录成为多顺反子mRNA，然后加工成各种成熟mRNA，作为翻译蛋白质的模板。
基因重叠：同一段DNA片段能够以两种或两种以上的阅读方式进行阅读，因而可编码2种及以上多肽（质粒和线粒体中也可存在）
病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，只有非常小的一份不被翻译
逆转录病毒基因组结构特点
有帽子结构和polyA尾巴
病毒颗粒携带2条相同的RNA和2条来自宿主细胞的tRNA，四条链以氢键结合在一起
是二倍体
逆转录病毒基因组
编码区（都含有3个基本结构基因）
gag编码病毒衣壳蛋白
pol编码肽链内切酶、一个反转录酶、一个前病毒整合相关的酶
env编码包膜蛋白
非编码区：与基因组复制和基因表达有关
基因表达调控
原核生物以大肠杆菌为例
原核生物基因表达特点
只有一种RNA聚合酶
基因表达以操纵子为基本单位，无内含子，转入单位为多顺反子
转录和翻译是偶联进行的
mRNA翻译起始部位有特殊的碱基序列：SD序列。起始密码子AUG上游4-13个碱基之前，一致序列为AGGAGG
原核生物基因表达调控主要在转录水平，即对RNA合成的调控。
原核生物
σ因子与转录起始的调控
转录起始的负调控
与lac阻遏蛋白结合的操纵基因区域具有反向重复序列，能与蛋白质特异结合的DNA特征性结构。
操纵元件在操纵子的位置是从-7至+28，RNA聚合酶所占的区域是从-35至+20，两者有部分重叠，因此阻遏蛋白和RNA聚合酶与DNA的结合是相互排斥的
转录起始的正调控
转录起始的复合调控
翻译水平的调控
阻遏蛋白对色氨酸操纵子的调控
衰减子对转录的调控
真核生物基因表达特点
细胞的全能性
基因表达的时间性和空间性
转录和翻译分开进行
初级转录产物要经过转录后加工修饰
初级转录产物为核不均一RNA （hnRNA），要经过带帽、加尾、切除插入的内含子和拼接外显子等过程才能形成成熟mRNA分子
部分基因多拷贝
不存在操纵子结构，真核生物的mRNA是单顺反子
真核生物
DNA水平的调控
染色质丢失
基因扩增
机制
基因反复复制
姐妹染色单体不均等交换
基因重排
如免疫球蛋白IgG基因重排
基因的甲基化修饰
直接作用：甲基化直接改变了基因构型，影响DNA特异顺序与转录因子的结合
间接作用：5'端调控序列甲基化后，与核内甲基化CpG序列结合蛋白结合，阻止转录因子与基因形成转录复合体
DNA去甲基化为基因的表达创造了一个较好的染色质环境
染色质结构对基因表达的调控
异染色质：高度密集状态
常染色质：较松散
转录水平的调控
反式作用因子的活性调节
表达式调节
共价修饰
配体结合
蛋白质与蛋白质相互作用
反式作用因子的作用方式
成环
扭曲
滑动
Oozing
反式作用因子的组合式调控作用
转录后水平的调控
5'端加帽
3'端多聚腺苷酸化
mRNA前体的选择性剪接
翻译水平的调控
翻译后调控
DNA损伤与修复的分子机制
DNA损伤的原因
DNA分子的自发性损伤
DNA复制产生误差
碱基错配
环出效应
DNA的自发性化学变化
碱基的异构互变（酮式和烯醇式，氨基式和亚氨基式）
碱基的脱氨基作用（C变成U，A变成H，G变成X）
脱嘌呤与脱嘧啶
碱基修饰语链断裂
物理因素
紫外线照射
使得同一条链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体
DNA链断裂
电离辐射
机制
自由基损伤
损伤DNA修复系统
MCI假说
DNA分子的变化
碱基变化
脱氧核糖变化
DNA链断裂
单链断裂
双链断裂
交联
DNA链交联
DNA-蛋白质交联
化学因素
烷化剂
亲电子的化合物
碱基烷基化
碱基脱落
DNA链锻炼
交联（双功能烷化剂引起，两处同时烷基化）：DNA链内，链间，及与蛋白质交联
分为单功能烷化剂（如甲基甲烷碘酸），双功能烷化剂
碱基类似物
碱基修饰剂
DNA损伤的后果
点突变
转换：嘌呤代替嘌呤，嘧啶代替嘧啶
颠换：嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤
缺失
插入
倒位或转位
倒位：一段核苷酸链方向倒置
转位：一段核苷酸链从一处迁移到另一处
DNA断裂
DNA修复通路
哺乳动物中较完善的是核苷酸切除修复，碱基切除修复，重组修复，错配修复
错配修复
大肠杆菌
MutS:识别错配的核苷酸
MutL：激活内切核酸酶MutH
MutH:在错配位点附近切断错配核苷酸所在的一条DNA链（MutH仅切割非甲基化DNA链即新合成的链）
Dam甲基化酶将回文序列5'-GATC-3'两条链中的A在N6位甲基化，复制叉通过时，模板链中GATC序列早就甲基、了，而新合成的晚几分钟甲基化，以便Dam酶识别并使之甲基化。
DNA聚合酶
DNA连接酶
真核细胞错配修复机制
直接修复
单链断裂修复：5'-P端和3'-OH端未受损的情况下，连接酶修复
光分解酶直接修复二聚体（人类基因组中未发现DNA光分解酶的同源基因）
甲基转移酶修复：该酶可将甲基化的鸟嘌呤（O6-甲基鸟嘌呤）和胸腺嘧啶（O4-甲基胸腺嘧啶）O位上的甲基转移给自己
直接插入修复：嘌呤插入酶催化游离嘌呤碱基与DNA无嘌呤部位形成糖苷键
碱基切除修复BER
主要针对DNA单链断裂、小的碱基改变、活性氧造成的氧化性DNA损伤
相关酶
APE-1
CRCC1
核苷酸切除修复NER
特点
是体内识别DNA损伤种类最多的修复通路，不识别任何特殊的碱基损伤，而是识别双螺旋形状的改变，如紫外线照射引起的嘧啶二聚体造成的变形；修复时切除含有损伤碱基的那一段 DNA。
GG-NER：能在基因组任何部位移除受损DNA
大肠杆菌
UvrA识别损伤部位
UvrB解链，3'-末端内切
UvrC:5'-末端内切
UvrD解旋酶（破坏氢键）
DNA聚合酶
DNA连接酶
人类
XPC蛋白：发现DNA双螺旋中的变形
XPB，XPD：解旋酶活性
ERCC-XPF：切割5'端
XPG：切割3'端
DNA聚合酶
DNA连接酶
TC-NER：转录偶联修复
人类
RNA聚合酶起损伤传感蛋白作用，转录偶联修复的核心是TFⅡH，在转录过程中打开DNA模板，在核苷酸切除修复时起DNA解旋酶作用。其亚基包括XPB和XPD
重组修复
适用于DNA双链断裂，细胞中必须存在姐妹染色单体
同源重组修复（S,G2期）
双链断裂
DSB加工
交联分子形成
第二末端捕获
DNA合成
DNA分离
人类
非同源末端连接修复（G1，G0期）
主要发生于免疫球蛋白VDJ重组时
人类
跨损伤修复（SOS修复）
存在于大肠杆菌，不存在于人类
正在复制的DNA聚合酶可能遇到尚未修复的DNA损伤，例如胸腺嘧啶二聚体，复制体必须设法跨越损伤进行复制，即使细胞不能修复这些损伤，自动防故障系统能够使复制体绕过损伤部位，这一机制就是跨损伤DNA合成。
线粒体损伤和修复
基因的损伤与修复异常所致疾病
遗传性非息肉性结肠癌HNPCC
（干细胞）错配修复基因突变
着色性干皮症
对紫外线照射造成的核苷酸损伤切除修复缺陷
基因结构与表达分析方法
DNA序列分析
双脱氧末端终止法
化学降解法
DNA序列分析的自动化
新一代DNA测序技术
核酸分子杂交技术
Southern印记杂交
Northern印记杂交
斑点杂交
反向斑点杂交
狭缝印迹杂交
原位分子杂交
直接检测目的核酸在固定的细胞或组织中的分布定位或拷贝数变化
液相杂交
基因芯片
聚合酶链反应
RT-PCR
是RNA先经逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应
实时荧光定量PCR
PCR体系里加入一定的荧光染料或探针，以实时检测PCR产物扩增情况，并依此绘制扩增线性图、对数图或标准曲线
多重-PCR
多重PCR体系中含有多对引物，能同时扩增同一基因内部或整个基因组上的多个区域
AS-PCR
根据引物3´端的互补与否，设计一对与正常或突变模板序列互补配对的特异引物，以进行特异性PCR
PCR-ASO
PCR-RFLP
先利用PCR扩增包括某一个或数个限制性核酸内切酶识别的特异基因片段，再用该限制性核酸内切酶消化PCR产物，电泳分析消化后DNA片段产物的长度或数目变化
Western免疫印迹技术
蛋白质芯片
疾病产生的分子基础
基因结构改变引起疾病
基因突变类型
点突变
转换
颠换
插入突变
缺失突变
反置或迁移突变
配子的突变
基因组拷贝数变异
≥1kbDNA片段数量的改变
遗传学效应
错义突变
无义突变
突变前编码某种氨基酸的密码子变成了终止密码子
同义突变
基因的一级结构发生了变化，但不引起蛋白质水平上的任何改变（由于遗传密码的简并性）
移码突变
引起hnRNA剪接改变
如家族性孤立性生长激素缺乏Ⅱ型遗传病
使hnRNA的正常剪接位点消失
产生新的剪接位点
基因结构改变致病的机理
蛋白质结构变化
镰状红细胞贫血症：β珠蛋白第六位密码子点突变，谷氨酸变成了缬氨酸，血红蛋白结构功能发生了改变（丢失了可被限制性内切核酸酶MstⅡ酶切开的位点，可用于诊断）。
家族性高胆固醇血症：LDL受体基因突变。LDL受体蛋白配体结合结构域由N端292个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸。该结构域中有7个由40个氨基酸残基组成的重复序列，每个重复序列中含6个半胱氨酸残基，全部42个半胱氨酸均以链内二硫键相连。7个重复序列的羧基末端均含有“天冬氨酸—半胱氨酸—X—天冬氨酸—甘氨酸—丝氨酸—天冬氨酸—谷氨酸”序列，这8个氨基酸残基中有4个带负电荷，形成的负电荷簇就是LDL受体的结合位点，能识别和结合其配体apoE和B100分子中带正电荷的精氨酸或赖氨酸残基。重复序列2、3、6、7是LDL受体识别和结合LDL必需的，其中任何一个重复序列发生突变均可使LDL受体丧失识别和结合LDL的能力。重复序列中半胱氨酸构成的二硫键能够牢固地稳定结合域的结构。
囊性纤维化：囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTCR）的基因突变所致。 CFTCR基因，所编码的蛋白质含有1480个氨基酸。其是一种离子通道功能型蛋白，与氯离子的跨膜转运有关。约70％的CF患者是因为CFTCR的ΔF508变异。该变异导致CFTCR基因上第10外显子上有一个三联体密码子缺失，使CFTCR蛋白508位上的苯丙氨酸缺失，产生了缺陷型蛋白质。
蛋白质合成量变化
珠蛋白基因表达特点
组织特异性
发育阶段特异性（α珠蛋白基因簇和β珠蛋白基因簇分别从各自的5'端开始进行表达）
协同性
地中海贫血
α珠蛋白合成受到抑制（α+）或缺失（α0）。目前至少发现3中α珠蛋白结构基因启示密码突变
β珠蛋白合成受到抑制（β-）或缺失（β0） 例如，第17位赖氨酸（lysine，Lys）密码子AAG第一个碱基A→T的点突变就产生终止密码TAG，形成无义突变，使珠蛋白肽链合成提前终止，引起β°—地贫。β珠蛋白基因的编码顺序内插入或缺失1个、2个、4个或7个核苷酸，会使突变点以后的读码框遭破坏，往往造成β珠蛋白肽链合成提前终止，而引起β°—地贫。目前已发现多种插入突变引起的β°—地贫。β珠蛋白基因的起始密码突变也能引起β—地贫。例如，我国发现了ATG→AGG突变，该突变影响β珠蛋白肽链合成的起始而产生β°—地贫。
调控序列变异导致基因表达水平变化
细胞间异常信号导致基因表达异常
甲胎蛋白AFP与肝癌
胚胎发育时，AFP增强子处于激活状态，沉默子处于抑制状态，AFP基因大量表达，AFP具有免疫抑制作用，保护胎儿免受母体的免疫攻击
胎儿出生后AFP沉默子活化，阻碍了增强子的启动效应，使得AFP表达收到抑制
异常细胞增殖信号作用下，癌基因表达异常增加，其表达产物与AFP基因顺式作用元件结合，激活AFP表达，通过细胞膜上AFP受体介导，影响淋巴细胞或肝癌细胞的TNF家族及其受体表达，导致肝癌细胞逃避机体免疫监视
矽肺与二氧化硅粉尘
1| 二氧化硅粉尘刺激肺支气管上皮（尤其是肺泡巨噬细胞）
2| 大量分泌转化生长因子-β1（TGF-β1）
3| TGF-β-1作用于成纤维细胞，促进细胞分裂，细胞外基质（ECM）蛋白基因表达，TGF—β1促进ECM相关受体的表达。
4| 成纤维细胞也可以调节IL-1、血小板衍生生长因子（PDGF）、TNF-α和TGF-β1等的产生，这些因子反过来又可以使成纤维细胞增加合成ECM，恶性循环
5| ECM在肺组织病理性蓄积，最终形成矽肺。
细胞内因素导致基因表达异常
细胞内信号异常
DNA甲基化异常
组蛋白异常修饰
非编码RNA引起基因表达改变
翻译后加工运输障碍
Ⅰ型泛发性白化病
酪氨酸酶的Cu2+结合位点（催化结构域）点突变导致酶活性降低或消失，黑色素合成减少或完全不能合成
酪氨酸酶结构域以外的某些突变导致其与内质网中的分子伴侣结合障碍，蛋白质不能正常折叠，滞留于内质网，无法完成成熟及运输
Ⅱ型泛发性白化病
P蛋白（参与酪氨酸酶蛋白从高尔基体到黑色素体的运输）基因突变导致酪氨酸不能正确地被转运至黑色素体
蛋白质降解异常
哺乳动物蛋白质降解途径
溶酶体途径：降解细胞吞入的胞外蛋白质
泛素-蛋白酶途径
载脂蛋白异常
阿尔茨海默病
病原生物基因引起疾病
外源性基因通过病原生物的感染进入体内，在人体的特定组织器官表达，病原生物得以生存、繁殖，引起机械或生物学损伤
病原生物基因在人体内大量表达，病原生物大量繁殖，与人体争夺营养物质，造成人体营养物质缺乏，引起疾病
病原生物基因在人体表达，可产生生物毒素作用于人体细胞，使细胞的一些生理功能或代谢异常，引起疾病
一些病原生物的基因整合到人体基因组中，改变一些基因的结构，或改变机体原有基因表达产物的结构和功能，或改变机体原有基因的表达水平，或引起新的异常蛋白质的表达，引起疾病的发生
基因治疗
策略
基因置换
将特定的目的基因导入到特定的细胞，置换原有的缺陷基因
基因添加
一、 通过导入正常基因的表达产物补偿缺陷基因的功能，缺陷基因并未除去
二、 导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的（如将细胞因子基因导入肿瘤细胞）
必要条件
对导入的基因及其产物有详尽的了解
外来基因能有效地导入靶细胞
导入的基因能在靶细胞中长期稳定存在
导入的基因能有适度水平的表达
基因导入的方法及其所用载体对宿主细胞安全无害
基因干预
抑制某个基因的表达或破坏基因结构使之不能表达
反义RNA
关键问题
特异性转移问题
反义RNA进入靶细胞前的降解问题（反义RNA抗RNase能力不强）
受体介导转移
应用前景
安全性高：反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变基因结构，反义RNA最终被降解
反义RNA设计和制备方便：可以化学合成，也可以获取靶基因关键序列后插入到表达质粒纵，体外转录得到
能直接作用于一些RNA病毒（如HIV-1）
具有剂量调节效应
干扰RNA
RNA干扰现象
RNA干扰是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，与双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制了该基因的表达
RNA干扰机制
①长双链RNA ( dsRNA)被 细胞内Dicer切成21~25个碱基对的短双链RNA（小干扰RNAsiRNA）
②siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体（RNA诱导的沉默复合体RISC）该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异位点将该mRNA切断或抑制蛋白质翻译
应用前景
研究基因功能的新工具
肿瘤的基因治疗
病毒性疾病的基因治疗
核酶
特点
具有酶活性的RNA，可降解特异的mRNA序列
与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击
核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子
核酶导入细胞的方法
外源导入
体外制备（合成或转录等）核酶后用脂质体包裹，导入细胞
内源导入
设计核酶的DNA双链，克隆到合适的真核表达载体上，将载体转入到靶细胞或组织，在细胞内表达核酶
结构
中间是保守区域（酶活性）
两端是与靶序列互补的区域
自杀基因治疗
将“自杀”基因导入宿主细胞，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而清除肿瘤细胞
自杀基因系统
丙氧鸟苷GCV被TK（胸苷激酶，源于单纯疱疹病毒）催化转化成GCV三磷酸，抑制DNA聚合酶活性
5-氟胞嘧啶（5-FC）被CD（胞嘧啶脱氨没，源于大肠杆菌）催化转化成5-氟尿嘧啶（5-FU）
旁观者效应：当转导细胞达到10%时，就能杀死大部分混合细胞（毒素的扩散？？）
基因免疫治疗
基因修饰肿瘤细胞“疫苗”疗法
将某些细胞因子导入肿瘤细胞，促使其表达特异抗原，从而诱发宿主CTL反应
细胞因子增强CTL和其他抗癌效应细胞作用
基因修饰TIL的过继免疫疗法
将细胞因子（如TNF-α）导入肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）
免疫增强基因疗法
将MHCⅠ类抗原基因导入肿瘤细胞，增强其免疫原性
原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法
诱导肿瘤特异性细胞毒反应，同时CTL产生旁观者效应
基因转移的途径
体内途径：将目的基因直接导入患者体内
体外途径：从患者体内获取靶细胞，导入目的基因，体外培养增殖、筛选等，将重组靶细胞输回患者体内
基因转移的基本技术
生物学方法
反转录病毒载体
组成
保留病毒包装信号，缺失病毒的包装蛋白基因
带有全套病毒包装蛋白基因，但缺失包装信号
该前病毒结构特点
两端各有一长末端重复序列LTR
LTR由U3、R和U5三部分组成，U3内有增强子和启动子，U3和U5两端分别有病毒整合序列（IS），在R内还有poly（A）加尾信号
病毒有三个结构基因： gag、pol和env基因
5'端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列，及剪接供体位点（SD），剪接受体位点（SA）
该载体系统特点
病毒包膜上由env编码的糖蛋白能被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别
病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。
前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达
包装好的假病毒颗粒以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。
缺点
随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；
病毒载体的容量较小，只能容纳8kb以下的外源基因
慢病毒载体
腺病毒载体
双链无包膜DNA病毒，通过受体介导的内吞作用进入细胞
优点
基因导入效率高
宿主范围广
基因转导与细胞分裂无关
重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注
腺病毒载体可插入7.5 kb外源基因
腺病毒载体在体外容易培养制备
缺点
不能整合到靶细胞的基因组DNA中（随分裂而丢失的机会增多，因此多用于研究神经细胞）
宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂
有可能产生复制型腺病毒：载体与辅助细胞或患者体内野生型病毒发生重组
靶向性差
腺相关病毒（AAV）载体
单链线状DNA缺陷型病毒，无包膜
B19
高效定位整合
可长期持续表达
载体容量小
感染效率低
成人中许多人感染过，存在免疫排斥
不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒，单纯疱疹病毒，痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染，因此对人类无致病性
单纯疱疹病毒载体
非生物学方法
脂质体介导
利用阳离子脂质体单体与DNA混合，自动形成包埋外源DNA的脂质体，与细胞一起孵育，通过细胞内吞作用将目的基因转移至细胞内
受体介导
将多聚阳离子与细胞或组织亲和性配体偶联，与配体共价连接后，通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围只留下配体暴露于表面。复合物可被带有特异性受体的靶细胞有效吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。
基因直接注射技术
其他：电穿孔法，磷酸钙共沉淀法、基因枪颗粒轰击、细胞显微注射、DEAE-葡聚糖法
基因克隆与基因体外表达
基因克隆的工具酶
限制性核酸内切酶
作用时不需要ATP 需要Mg2+
分型
限制性核酸内切酶命名
通常识别和切割位点是4-6个碱基对，又有回文序列，大多数错位切割产生粘性末端。对一段特定的DNA而言，识别序列碱基对少，则切点数多，产生的片段小，识别序列碱基对多则切点数少，产生的片段大
同工异源酶
来源不同但能识别和切割同一位点的酶
同尾酶
识别序列不同但产生相同的粘性末端
DNA聚合酶Ⅰ
5'→3'聚合酶活性
3'→5'核酸外切酶活性
5'→3'核酸外切酶活性
DNA聚合酶Ⅰ大片段
DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）裂解后产生的大片段,称为Klenow片段
5'→3'聚合酶活性
3'→5'核酸外切酶活性
无5'→3'核酸外切酶活性
用途
补齐双链DNA的3'末端
通过补齐3'端，使3'末端标记
在cDNA克隆中，合成第二股链
用于DNA序列分析
（常用的）反转录酶
多用于构建cDNA文库
禽类成骨细胞性白血病病毒（AMV）反转录酶
Moloney小鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶
T4DNA连接酶
使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来
碱性磷酸酶
能去除DNA或RNA5'端的磷酸，制备载体时使用，可防止载体自身环化
末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）
非模板依赖性地合成DNA，用于探针标记/在载体和待克隆片段上形成同聚物尾
基因克隆的基本过程
目的基因的获得
从基因组文库中获得
从cDNA文库中获得
与成熟mRNA相当，不含内含子，不同种类不同状态的细胞有不同的cDNA文库
PCR扩增特定基因
人工合成
载体的选择与准备
克隆载体
质粒
λ噬菌体
插入型载体
替换型载体
粘性质粒
M13噬菌体
病毒载体
要求
至少一个复制起点
具有一个以上的遗传标记，便于区分宿主细胞中有无载体
具有多个限制性内切核酸酶的单一切点，便于外源基因插入
表达载体
原核表达载体
真核表达载体
DNA分子的体外连接
相同粘性末端
不同粘性末端
人工接头的使用
接头中可以有多个酶切位点，目的基因中无相应的酶切位点
1. 含有酶切位点的寡核苷酸片段在T4DNA连接酶作用下连接到目的DNA片段两端
2. 用相应的限制性内切酶切割产生粘性末端
3. 载体用同一限制性内切酶线性化
4. 载体与目的DNA片段连接
加入同聚物尾
平端连接
外源基因导入宿主细胞
转化
感受态细胞
感染
转染
目的基因的筛选与鉴定
遗传学方法
插入灭活法
α-互补
免疫学方法
核酸杂交法
PCR技术
酶切鉴定
基因诊断
方法详见
概念
用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体状态与疾病作出诊断的方法
目标分子
基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA或者蛋白质
检测的基因有内源性（即机体自身基因 ）和外源性（如病毒、细菌等）两种，前者用于检测基因及基因表达的存在状态或有无缺陷，后者用于检测有无病原体感染
特点
高特异性
高灵敏性
早期诊断性
应用广泛性
技术路线
直接诊断途径
直接分析致病基因分子结构及表达是否异常
必要条件
被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系
被检基因正常分子结构已被确定
被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知
思路
点突变检测
基因重排检测
基因表达异常检测
间接诊断途径
利用多态性遗传标记与致病基因进行连锁分析
采用原因：
致病基因未知或基因序列未确定
致病突变机理不清
致病位点不便检测
思路
限制性片段长度多态性分析
单个多态位点连锁分析
多个多态性位点连锁分析
串联重复序列长度多态性分析
遗传病基因诊断
镰状细胞贫血病
ASO杂交法检测
Sourthern Blot分析
PCR-RFLP分析
RFLP标记的连锁分析
血友病
脆性X染色体综合征
传染病基因诊断
病毒性疾病
细菌性疾病
寄生虫病
恶性肿瘤基因诊断