生物化学-核酸

生物化学-核酸的思维导图，内容有 核酸通论、核酸的结构、核酸的物理化学性质、核酸的研究方法，一起来看。

核酸

• 核酸通论
  • 简史
    • - DNA双螺旋模型： - 脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接而成 - 两条主链，反向平行，同一轴心，右手螺旋 - 中心法则 DNA RNA PR - DNA重组技术 DNA切割技术、分子克隆、快速测序 - 基因工程 改变生物机体性状特征、改造基因乃至改造物种
  • 核酸的种类和分布
    • DNA
      • - 分布 - 原核生物DNA集中于核区，真核生物集中于核内 - 病毒只含DNA或RNA - 线粒体、叶绿体 - 特点 - 含有生物物种所有遗传信息，分子量很大 - 真核生物染色体为线型双链，末端具有高度重复序列构成的端粒结构 原核生物染色体一般为环状双链（染色体DNA、质粒DNA、真核生物细胞器DNA） - 病毒DNA - 动物病毒DNA为环状/线型双链 - 微小病毒是线型单链DNA，末端常形成发夹结构 - 植物病毒基因组多为RNA，是线型双链或环状单链 - 痘病毒DNA末端为封闭凸环状
    • RNA
      • - 特点 - 分子量比DNA小 - 一般以单链形式存在，局部可形成双螺旋、凸起、茎环或发卡结构（因此RNA的碱基配对区可以是规则的双螺旋，也可以是连续的部分双螺旋） - 含有非waston-crick配对的碱基，如G-U配对，增强了RNA链的自我配对能力，更易形成双螺旋结构，常常出现局部碱基配对 - 具有核糖和嘧啶，通常是单链线型分子 - 可折叠形成复制的三级结构 - 环状RNA 封闭环状，不受RNA外切酶影响，不易被降解 - 种类 - mRNA - tRNA - rRNA - 非编码RNA
  • 核酸的生物功能
    • - DNA是主要的遗传物质 - RNA参与蛋白质的合成 - RNA功能的多样性 - 某些病毒的遗传物质 - 催化功能（作为核酶催化一些重要的反应，主要作用于初始转录产物的剪接加工） - 参与细胞内蛋白质的合成 - 遗传信息的加工 - 基因表达和细胞功能调控 - 染色体的结构稳定和组装
• 核酸的结构
  • 概述
    • - 核酸是一种多聚核苷酸，基本结构单位是核苷酸 - 核苷酸进一步分解为核苷和磷酸；核苷进一步分解为碱基和戊糖。碱基分为嘌呤碱和嘧啶碱；戊糖分为D-核糖和D-2-脱氧核糖
  • 核苷酸
    • 碱基
      • - 嘌呤碱基：A、G - 嘧啶碱基：C、T - DNA中碱基：ATCG - RNA中碱基：AUCG - 稀有碱基：二氢尿嘧啶、假尿嘧啶核苷、甲基化的嘌呤等
    • 核苷
      • 核苷是一种糖苷，由碱基和戊糖通过糖苷键连接缩合而成。糖的第一位C原子与嘧啶碱基的第一位N原子或嘌呤碱基的第9位N原子相连。
    • 核苷酸
      • - 核苷中的羟基戊糖被磷酸酯化形成核苷酸，核苷酸就是核苷的磷脂酸 - 生物体内的游离核苷酸是5'-核苷酸 - 用碱水解RNA时，可得到2'与3'核苷酸混合物 - 核苷酸的衍生物：ATP类高能磷酸键；辅酶核苷酸；环化核苷酸
    • 核苷酸的生物功能
      • - 核苷酸是核酸合成的前体 - 核苷酸衍生物是许多生物合成的中间活性物 - ATP是能量代谢中通用的高能化合物 - 腺苷酸是三种重要辅酶的组分 - 某些核苷酸是重要的调节物质（cAMP、cGMP是第二信使等）
  • 核酸的共价结构
    • - 核苷酸连接方式：3'-5'磷酸二酯键 - 一级结构的走向为5'-3' - 不同DNA分子中具有不同的核苷酸顺序，携带不同的遗传信息 - DNA的一级结构：DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序及连接方式（碱基的顺序），为储存遗传信息的形式 - RNA的一级结构：RNA分子中核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。除4种碱基外含有稀有碱基 - mRNA - rRNA - tRNA
  • DNA的高级结构
    • - waston、crick DNA双螺旋结构
    • DNA的二级结构
      • DNA双螺旋结构模型特点： - 两条多肽链主链，反向平行，绕同一螺旋轴，右手螺旋 - 磷酸和核糖位于外侧（形成亲水性骨架）；疏水性碱基位于内侧 - DNA双链之间形成互补碱基对（AT间两个氢键；GC间3个氢键） - 碱基的氢键和疏水作用力共同维持DNA双螺旋的稳定 - 理化性质 - DNA双螺旋平均直径为2nm，相邻碱基对0.34nm - 沿螺旋的长轴一圈10个碱基对，螺距为3.4nm - 碱基对堆积、糖-磷酸骨架扭转，表面产生2条不等宽的沟（大沟和小沟） - DNA双螺旋结构分为A B C D E Z等构型，除Z型为左手螺旋外其他为右手螺旋
    • DNA的三级结构
      • - DNA的三级结构是DNA在其二级结构的基础上进一步扭曲折叠盘旋形成的特定构象。包括单链与双链、双螺旋与双螺旋的相互作用。 - 超螺旋是DNA三级结构的主要形式，由双螺旋进一步盘旋折叠而成。超螺旋包括正超螺旋和负超螺旋（左手螺旋）两种。盘旋方向与DNA双螺旋方向相同（正超螺旋），相反（负超螺旋）。 - 生物体内，绝大多数环形DNA以负超螺旋形式存在
    • DNA超螺旋结构形成的意义
      • - 使DNA形成高度精密状态装入核中 - 推动DNA结构转化满足功能上的需要 - 负超螺旋利于复制和转录
    • DNA蛋白质复合物的结构
      • - 生物体内核酸与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白形式存在 - 基因组DNA与蛋白质结合形成染色体 - 病毒可以看做游离的染色体 - 真核细胞在间期DNA组装成染色质，具有各种活性，如复制和转录 - 有丝分裂间期，染色质进一步组装成染色体，便于DNA分配到子代细胞
    • 真核生物染色体
      • - 染色质的结构单位是核小体 核小体：染色质的基本结构单位，由组蛋白核心及盘绕其上的DNA所构成。 组蛋白核心:组蛋白H2A、H2B形成的二聚体2分子、H3、H4形成的二聚体2分子组成一个八聚体，DNA以左手螺旋形式在组蛋白核心上盘绕1.75圈。核小体由连接DNA相连，再进一步盘旋成高度压缩的染色体。组蛋白H1结合在DNA上，封装核小体，使核小体彼此靠近。 - 组蛋白富含碱性氨基酸
  • RNA的高级结构
    • - RNA通常是单链型分子，但是自身回折形成局部双螺旋（二级结构），进而折叠形成三级结构 - 除tRNA外，几乎所有RNA都与蛋白质结合形成核蛋白体 - RNA复合物承担重要的细胞功能，如核糖体、信息体、信号识别颗粒、拼接体、编辑体等。 - tRNA - 二级结构三叶草形，三级结构倒L形 - 二级结构：氨基酸臂/受体臂；二氢尿嘧啶环；反密码子环；额外环；胸苷-假尿苷-胞苷环 - 功能：蛋白质合成中氨基酸载体；反密码子环识别mRNA密码子 - rRNA - 单链，螺旋化程度低 - 与蛋白质结合后形成核糖体发挥功能 - 细胞中含量最多的RNA，与核糖体蛋白（r蛋白）共同构成核糖体 - 原核生物：5S，16S，23S - 真核生物：5S,5.8S,18S,28S - mRNA - 蛋白质合成模板 - 5'cap，3' poly A tail - 维持mRNA稳定性，协同mRNA从细胞核向细胞质转运；在蛋白质合成过程中促进核糖体和翻译起始因子的结合 - 
• 核酸的物理化学性质
  • 核酸的水解
    • - 两种戊糖，可以形成4种糖苷：嘌呤核苷、嘌呤脱氧核苷、嘧啶核苷、嘧啶脱氧核苷。 - 磷酸基与这两种糖形成核糖磷酸酯和脱氧核糖磷酸酯
    • 酸水解
      • - 磷酸酯键和糖苷键都能水解 - 糖苷键比磷酸酯键更容易水解 - 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键更容易水解
    • 碱水解
      • - RNA的核糖含有2'-OH，碱水解作用下形成磷酸三酯不稳定，随即水解为2'-核苷酸和3'-核苷酸 - DNA的脱氧核糖无2'-OH，不能形成碱水解中间产物，故不能水解 - 生理意义：DNA更稳定；RNA为DNA的信使，完成任务后迅速水解
    • 酶水解
      • - 磷酸二酯酶 非特异性水解磷酸二酯键 - 核酸酶 专一性水解核酸的磷酸二酯酶 - 核酸酶的分类 - 按底物专一性：核糖核酸酶；脱氧核糖核酸酶 - 按对底物的作用方式：核酸内切酶；核酸外切酶 - 按磷酸二酯键断裂方式：3'-0H与磷酸基之间断裂（产物为5'磷酸核苷酸或寡核苷酸）；5'-OH与磷酸基之间断裂（产物为3'磷酸核苷酸或寡核苷酸） - 按对底物的二级结构的专一性（单/双链酶）；核酸外切酶作用的方向 - 核糖核酸酶类 - 牛胰核糖核酸酶 - 核糖核酸酶T1 - 核糖核酸酶T2 - 脱氧核糖核酸酶类 - 牛胰脱氧核糖核酸酶 - 牛脾脱氧核糖核酸酶 - 链球菌脱氧核糖核酸酶 - 限制性内切酶 降解外源DNA，具有严格的碱基序列专一性
  • 核酸的酸碱性质
    • 碱基的解离 - 核苷的解离 戊糖存在，增强了碱基酸碱性解离； - 核苷酸的解离
  • 核酸的紫外吸收
    • 260nm处有最大吸收峰（嘌呤碱和嘧啶碱的共轭双键体系） 定量测DNA和RNA
  • 核酸的变性、负性、杂交
    • DNA变性
      • - 在某些物理化学因素下，DNA的双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，使DNA双链变为单链的现象。引起变性的因素有热变形、酸碱变性、变性剂等。 - 增色效应：在DNA变性过程中，由于共轭双键的暴露，使DNA在260nm处紫外吸光度增加的现象 - DNA变性特点 - 260nm紫外吸光度增加 - 粘度降低 - 浮力密度升高 - 双折现象消失 - 比旋下降 - 酸碱滴定曲线改变
    • DNA复性
      • - 除去变性因素后，解离的DNA双链重新互补配对恢复原有双螺旋结构的现象。 - 减色效应：随着DNA复性，共轭双键更少暴露在外，含DNA的溶液在260nm处紫外吸收降低的现象 - 影响复性的因素 - DNA片段越大，复性越慢 - DNA浓度越高，复性越高 - 具有较多重复序列的DNA，复性快
    • Tm值
      • - 在DNA变性解链的过程中，紫外吸光度达到最大值一半时的温度 - 影响Tm值大小因素 - DNA长短及碱基GC含量相关（GC含量高，Tm大） - 离子强度低，Tm低 - Tm值受样品均一性影响（衡量样品均一性）
    • 核酸杂交
      • 将不同DNA单链或RNA放在同一溶液中，只要两种核苷酸单链之间存在一定程度的碱基配对，就有可能形成杂化双链，这种现象称为核酸杂交。 应用 - 分子杂交技术 利用DNA变性和复性这一基本特征，结合印记技术和探针技术，可对DNA和RNA进行定量或定性分析 - 印迹技术 - DNA印记 Southern Blot - RNA印记 Northern Blot - 蛋白质印记 Western Blot - 探针技术 带有可检测标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，用于检测样品中存在的特定基因
• 核酸的研究方法
  • 核酸的分离、提纯和定量测定
    • DNA的分离
      • - 真核生物DNA与组蛋白结合成核蛋白（DNP），DNP溶于水和浓盐溶液但不溶于生理盐溶液。因此，先用浓盐溶液对DNP进行提取，随后用稀盐溶液使DNP沉淀并分离出来，在经过多次分离纯化得到DNA。 - 用苯酚抽提，除去蛋白质。 - 用氯仿-辛醇（或异戊醇）与DNP溶液震荡，借助表面变性除去蛋白质，反复多次直至得不到蛋白质的DNA。 - 氯化铯密度梯度离心
    • RNA的分离
      • - RNA比DNA更不稳定，RNase无处不在，因此在分离时更为困难 - 制备RNA需注意： - 制备RNA方法 - 酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提法抽提 - 胍盐/氯化铯法 - 分离poly A通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸亲和层析法 - 核酸含量的测定法 紫外分光光度法、定磷法、定糖法
  • 核酸的超速离心
    • - 密度梯度沉降平衡法 - 核酸密度的测定 - 测定核酸中GC含量 - 用于核酸的制备 - 溶液中核酸构象的研究
  • 核酸的凝胶电泳
    • - 简单、快速、灵敏、成本低；可以在水平、垂直电泳槽中进行 - 凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重效果，分离效率高
    • 琼脂糖凝胶电泳
      • 
    • 聚丙烯酰胺凝胶电泳<img src="/home/zgh/.config/Typora/typora-user-images/image-20220711213153764.png" title="fig:" alt="" />
  • 核酸的核苷酸定量测定
    • - DNA的酶法测序 - DNA的化学法测序 - RNA的测序
  • DNA聚合酶链反应（PCR）
    • - 基本步骤 - 设计引物 有助于有效扩增所需要的的DNA序列；尽量减少产生非特异性产物 - 优化反应体系 反应体系包括： - 热循环 - 变性 94℃，45~60s - 退火 两个引物中较低的Tm-2，1min - 延伸 72℃；热循环25~30个周期；最后延伸10min - 检测 凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线下检查结果 - PCR应用