中性粒细胞细胞外陷阱（NETs）降解的分子机制

尽管许多研究一直在探索驱动 NET 形成的机制，但很少有人关注这些结构的退化和消除。NETs 清除和细胞外 DNA、酶蛋白（中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶 3、髓过氧化物酶）或组蛋白的有效清除对于维持组织稳态、预防炎症和避免自身抗原的出现是必需的。循环和组织中 DNA 纤维的持续存在和过多可能对宿主产生严重后果，导致各种全身和局部损伤的发展。NET 被细胞外和分泌的脱氧核糖核酸酶 (DNases) 的协同作用切割，随后巨噬细胞在细胞内降解。NET 的积累取决于 DNase I 和 DNAse II 水解 DNA 的能力。此外，巨噬细胞主动吞噬 NETs，而 DNase I 对 NETs 的预处理促进了这一事件。本综述的目的是介绍和讨论目前关于 NETs 降解机制的知识及其在血栓形成、自身免疫性疾病发病机制中的作用疾病、癌症和严重感染，以及讨论潜在治疗干预的可能性。

中性粒细胞细胞外陷阱（NETs）降解的分子机制

• NETs的生成及生物学作用
  • 有抗菌酶和组蛋白的染色质纤维制成的网状结构，作为陷阱，固定和杀死微生物，从而限制其传播。中性粒细胞释放的NET主要通过称为NETosis的细胞死亡机制发生
    • NET是组织和血管中中性粒细胞抗菌反应的重要因素。
    • 中性粒细胞有能力通过释放介质的货物积极参与多个细胞和分子级联，包括组蛋白、金属蛋白酶、细胞因子、游离DNA、蛋白酶和ROS
    • NETs有助于免疫细胞的过度激活、循环中血栓的产生、内皮和上皮细胞损伤、血管和支气管闭塞、局部组织破坏、炎症反应恶性循环的放大等
    • NET与树突状细胞和巨噬细胞相互作用，而巨噬细胞反过来释放白细胞介素1β（IL-1β）和干扰素α（IFNα）。NET还可以激活T细胞来释放IFNα和IFNγ，
  • 包括内毒素在内的微生物产品激活中性粒细胞，并得到血小板、促炎细胞因子或其他危险信号的支持→→几个分子与中性粒细胞受体（如Toll样受体（TLR）和补体）结合，以激活中性粒细胞并触发NETosis→→激活烟酰胺-腺嘌啶-二核苷酸-磷酸（NADPH）氧化酶和细胞内颗粒蛋白酶→→PAD4介导的组蛋白瓜氨酸化和染色质解凝→→中性粒细胞的核膜破裂，解凝核染色质被排出，与细胞质和颗粒成分混合，包括中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、抗菌肽（LL37）、高流动性组蛋白B1（HMGPB1）和组织蛋白酶G和蛋白酶3→→细胞膜渗透，NET从细胞中释放出来，中性粒细胞在NETosis过程中死亡
    • 瓜氨酸化由肽基氨酸脱氨酶4（PAD4）介导，该酶通过将精氨酸残基转化为瓜氨酸来去除核心组蛋白中的正电荷，从而削弱组蛋白和DNA之间的相互作用
  • 非自杀性NETosis,保持粒细胞结构完整性的替代机制，从核膜的破损和在没有核破坏的情况下在细胞外快速输出含有网的微泡开始。这是吸引到感染部位的浸润粒细胞的快速反应。中性粒细胞在驱逐DNA后保持活力并保持对抗细菌的能力。
  • NET可以从线粒体DNA中生成，线粒体移动到细胞表面并排出NET。
• 临床病理学中的NETs
  • 肿瘤中的NETs：NETs是促进肿瘤生长和转移形成的重要参与者
    • 唤醒休眠癌细胞； 促进癌细胞扩散； 增强癌症的增殖和迁移； 通过分泌蛋白酶为转移肿瘤提供利基质来调节细胞外基质
      • NETs启动EMT，并增强癌细胞的迁移和侵入能力
      • 循环肿瘤细胞可通过被NETs纤维包裹并带到远处的器官，形成淋巴或血源性转移
      • NET助长了与癌症相关的血栓形成
      • NETs围绕着原发性肿瘤形成屏障，阻止细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的进入，从而促进免疫免疫监测的逃逸
        • 负责发展免疫抑制微环境，促进肿瘤生长，从而允许进展和转移。
  • 自身免疫性疾病中的NETs：NETs成分可以作为损伤相关分子模式(DAMPs)。
    • PAD4对组蛋白的瓜氨酸化和RafMEK-ERK信号通路的激活被认为是它们各自对组蛋白降解和抗凋亡通路表达的影响所必需的，随后导致去致密染色质DNA的释放
  • Coagulation：NET的所有成分（DNA、组蛋白酶和蛋白酶）在血管腔室和周围组织中表现出促凝血特性
    • NETs通过激活血小板粘附和聚集来促进静脉、动脉和微血管血栓形成，为血小板和纤维蛋白的血栓形成提供物理支架，并且是红细胞的陷阱
    • NETs（dsDNA、髓过氧化物酶-DNA复合物和瓜氨酸化组蛋白）的残留物→→增加包括凝血酶在内的凝血因子的蛋白酶活性→→激活凝血级联
    • 衍生的dsDNA——直接激活凝血的外在途径； NETs残留物——诱导激活的血小板和单核细胞的组织因子释放——促进血栓形成——启动内在途径
    • 组蛋白损害凝血抑制剂包括血栓调节蛋白的功能，从而促进凝血酶的产生
    • 中性粒细胞弹性蛋白酶通过灭活组织因子通路抑制剂促进凝血，从而进一步增加体内凝血和纤维蛋白沉积
    • 中性粒细胞外陷阱驱动的闭塞性疾病
  • 新冠肺炎和其他严重感染中的NET
  • NETs可以促进影响中枢神经系统的各种疾病的致病机制：主要是影响血栓形成
• NETs降解机制
  • DNA降解酶： NETs由细胞外和分泌的DNases的协同作用分裂，然后由巨噬细胞在细胞内降解
    • DNase I家族： DNase I、DNase1L1、DNase1L2和DNase1L3
      • DNase1和DNases1L3降解DNA是NETs积累的速率限制因素。
      • DNA酶I主要由胰腺和肾脏产生，是存在于血液和其他体液中的主要核酸酶，它能将细胞外dna切割成具有30-羟基和50-磷酸末端的片段
      • 树突状细胞使用DNase1L3降解NET。
      • 生理浓度的DNase I不足以完全降解NETs
      • 肿瘤组织中 DNASE1L3 表达不足是导致 NETs DNA 去除受损的关键原因
        • NETs 积累→激活 cGAS-ncNF-κB 信号通路导致 DNA 引发的 HCC 细胞侵入。DNASE1L3 在 HCC 组织中的表达低→→富含 NETs DNA 的微环境，从而促进癌症侵袭和/或转移
    • DNase II家族： DNase II α、DNase II β和L-DNase II
      • DNA酶II消化DNA的磷酸二酯主干，形成两个具有30-磷酸和50-羟基末端的片段。该酶在缺乏二价阳离子和酸性ph值时具有最高的活性
      • DNase II存在于包括巨噬细胞在内的各种细胞的溶酶体和多个组织中，这表明这种酶在外源DNA吞噬片段的水解中的作用，这些碎片主要来自凋亡细胞
    • 所有基因均由DNase I和DNase II编码，而假定的编码L-DNase II的基因是SERPINB1
    • DNAses在凋亡期间起着重要作用，其缺乏会激活先天免疫反应
  • 其他可降解NETs结构的酶：如3′-外切酶（TREX1和TREX2）
    • TREX1切割DNA复制、细胞凋亡、网状体、DNA修复和重组途径过程中剩余的DNA片段。
    • TREX1通过BAK/BAX依赖性过程激活cGAS-STING细胞内通路，导致I型干扰素合成和免疫失调/自身免疫失衡
    • 巨噬细胞对NET的细胞内降解也取决于TREX1功能
    • TREX2支持角质细胞的基因组完整性，在DNA损伤去除和去除片段降解中发挥作用[29]。 TREX2复合物参与哺乳动物细胞的转录过程和核信使RNA传输
  • NETs被巨噬细胞降解： 巨噬细胞是细胞外DNA降解的关键调节剂
    • 吞噬细胞NETs元素不会引起炎症反应，然而，如果用LPS等微生物产物预活化，它们会分泌促炎细胞因子，如IL-1β、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），并开始有效的抗原呈现
    • 多形核细胞（PMN）和巨噬细胞之间的相互作用被认为是调节炎症的关键机制
    • 巨噬细胞能够通过获取细胞外DNA来有效清除NET
      • 其分泌DNase I对NET大碎片的细胞外消化，分泌补体因子1q（C1q）的NET的Opsonization（调理素作用）促进了这一过程
    • 巨噬细胞内NET或NET DNA的转染会刺激干扰素的产生，而巨噬细胞对NET的正常吸收在免疫学上是无声的，即没有诱导任何免疫反应介质的产生
    • 人主动脉瘤组织样本中的局部巨噬细胞密度与组织中 NET 的存在呈负相关
    • DNase 2 的敲低不会抑制非极化巨噬细胞对 NET 的降解，巨噬细胞有效分解 NET 需要细胞质 TREX1 活性。
    • 巨噬细胞中脱氧核糖核酸酶的主要分泌形式是 DNase 1L3，DNase IL-1 集中定位于活化巨噬细胞的丝状伪足中。
    • 巨胞饮作用是一种在巨噬细胞摄取 NET 中发挥作用的重要机制，无论是在体外还是在体内
    • 抑制肌动蛋白聚合或吞噬体-溶酶体融合来阻断吞噬作用也减少了 NETs 分解
• NET 退化缺陷
  • SLE 中的 NETs 退化缺陷： 使用DNASE基因敲除小鼠进行的体内研究证实了 DNase 活性与自身免疫性疾病之间的直接相关性
    • DNase 突变与多种自身免疫性疾病有关，任何DNASE的缺失或突变，尽管很少见或极其罕见，但总是与伴有自身免疫性肾小球肾炎的慢性炎症有关
  • TREX缺陷
• NETs 抑制药物的潜在应用
  • 细胞外核蛋白的消化可能具有预防和治疗 PMN 介导的疾病的巨大潜力，包括自身免疫性疾病、炎症反应加剧、严重感染和癌症。
  • 某些广泛应用的 SLE 治疗药物，如他克莫司、环孢菌素 A 和氯喹，针对 NETs 成分或干扰 NETs 形成机制
  • 调节 NET 产生或 DNA 去除似乎是 SLE/LN 治疗中两种可能的有效策略，两种方法的平衡可能产生协同作用
  • AAT 结合细胞外 IL-8，减少中性粒细胞流入炎症部位并增加中性粒细胞超氧化物的产生，从而抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的活性
    • AAT 作为 S 蛋白裂解抑制剂表达天然抗 SARS-CoV-2 活性
  • 重组 DNases 可能作为单基因 SLE 的潜在药物发挥非常重要的作用。
  • 钙调神经磷酸酶抑制剂阻断 NETosis 所需的钙动员（环孢素 A 和他克莫司）是治疗 SLE 患者的有效药物
  • N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 是一种有效的 ROS 清除剂，由于其对 ROS 产生的强烈依赖，它具有抑制 NETs 挤出的作用
  • Mito TEMPO 是一种 ROS 产生的特异性抑制剂，它阻碍了 NETosis 并同时降低了小鼠 SLE 的活性
  • 抗 NETs 疗法被认为可以阻止休眠癌细胞的觉醒，从而抑制肿瘤的扩散和转移的形成