高中生物选修一专题四血红蛋白的提取和分离

高中生物选修一专题四课题3血红蛋白的提取和分离，血红蛋白英文缩写为HGB或Hb。血红蛋白是红细胞内运输氧的特殊蛋白质，是使血液呈红色的蛋白，由珠蛋白和血红素组成，其珠蛋白部分是由两对不同的珠蛋白链（α链和β链）组成的四聚体。更多干货内容赶快收藏起来慢慢看吧！

血红蛋白的提取和分离

基础知识

凝胶色谱法

定义：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法

实质：一些微小的多孔球体（大多数是由多糖类化合物，如葡聚糖和琼脂糖）

原理：相对分子质量较小的蛋白质易入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢，后出；较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，先出

缓冲溶液

作用：模拟生物体内，保持正常的结构和功能

人体内

NaH2PO4／NaHPO4和H2CO3／NaHCO3

电泳

定义：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程

原理：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度

常用方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳

迁移率取决于净电荷的多少有分子的大小

加SDS，使蛋白质变性，使测定的结果为单条肽链的分子量；SDS负电荷量远大于蛋白质分子原有电荷量，掩盖不同种蛋白质间电荷差别，使电泳迁移率全完取决于分子的大小

血红蛋白

红细胞

10%水

90%血红蛋白

α－肽链×2＋β－肽链×2（条链环绕一个亚铁血红素基团）

基团可携带场一子氧或一分子二氧化碳

血红蛋白因含有血红素而呈红色

来自

猪、牛、羊或其他哺乳动物

实验操作

步骤：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定

加抗凝血剂柠檬酸纳，防止血液凝固

样品处理及粗分离

红细胞的洗涤

目的：去除杂蛋白

低速短时间离心，分离红细胞加入五倍体积的生理盐水， 低速短时间离心，如此重复洗涤三次， 直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净

洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白； 离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果

血红蛋白的释放

加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯， 置于磁力搅拌器上充分搅拌

蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破；甲苯溶解细胞膜，从而使血红蛋白释放出来

分离血红蛋白溶液

离心

滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层 于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体

透析

目的：去除相对质量较小的杂质

装入透析袋中放入磷酸缓冲液

由硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的 透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内

加快透析：①增加缓冲液量②即时更换缓冲液

凝胶色谱制作

凝胶色谱柱的制作

色谱柱的高，缓冲液，还有样品的分布会影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度，而色谱柱的直径不会影响

将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1~2h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气

凝胶色谱柱的装填

使用交联葡聚糖凝胶（SephadexG-75）

“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g

装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙

装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填

样品的加入和洗脱

将色谱柱垂直固定在支架上，加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口

用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

小心加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱

如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功

电泳

目的：进行蛋白质纯度的鉴定

用SDS -- 聚丙烯酰胺凝胶电泳