人源干细胞产品药学研究与评价技术指导原则

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人源干细胞产品药学研究与评价技术指导原则

• 应对直接接触的包装材料和密封容器的功能性和相容性进行研究，功能性研究比如密封性、耐低温性，相容性研究可参考相关技术指导原则开展。
• 包装及密封容器系统
• 稳定性研究
  • 指导原则
    • ICH Q5C
    • 生物制品稳定性研究技术指导原则
  • 目的
    • 为干细胞产品的储存、运输和使用提供支持
  • 研究内容
    • 影响因素实验
      • 温度
      • 光照
      • 机械力
    • 加速实验
    • 长期实验
    • 运输实验
    • 临床使用中稳定性实验
  • 试验样品
    • 原液（如有)
    • 成品
    • 工艺中间品
  • 试验条件应充分考虑新鲜细胞和冻存细胞的区别，考虑干细胞产品保存、包装、运输、临床配伍和实际给药的特殊要求，考虑各个环节样品累积的储存时间对最终产品稳定性的影响等
  • 申报临床阶段的稳定性数据应能够支持临床试验开展，即稳定性研究的期限应至少能够涵盖所开展的临床试验的要求，证明产品从放行至患者给药的有效期是合理的。申报上市时需提供多个代表性批次的稳定性数据以支持和确定贮藏条件、使用条件和有效期，同时应明确产品的敏感条件、细胞状态或质量随时间的变化情况等。
• 稳定性研究
• 质量标准
  • 建立原则
    • 应采用经验证的分析方法，评估产品的鉴别、纯度、无菌性和活性，应体现干细胞产品的质量特点。
    • 限度的设定应能确保产品的安全性、有效性和批间一致性
  • 建立流程
    • 确定质量研究的内容、进行方法学研究、确定质量标准的项目及限度、制订及修订质量标准
  • 建立项目
    • 细胞鉴别
    • 细胞活性：细胞活率、活细胞数、功能细胞数、群体倍增时间
    • 纯度：目的细胞比例等
    • 生物学活性：分化效率、定量/半定量功能测定、标志物等
    • 产品和工艺相关杂质
    • 成瘤性/致瘤性
    • 非预期分化
    • 微生物安全性：无菌、内毒素、支原体、内外源病毒
    • 一般检测：外观、pH 值、明显可见异物、渗透压摩尔浓度、装量等
      • 使用前检查必须至少包含外观、颜色、鉴别和包装完整性等检测
  • 特殊要求
    • 在细胞基质鉴定和检测中使用更先进方法和技术改进时，证明新方法的专属性、灵敏度和精密度至少与现有方法相当
    • 有关生物标志物的分析方法验证应规范开展，特别关注阳性对照的设计与验证
    • 尽可能采取多种正交的分析检测方法进行生物学活性测定研究，并完成方法学验证
    • 方法研究中还应考虑活性组分之间潜在的非累加效应，例如干扰效应或协同效应
    • 采用尽可能敏感的方法定量检测与生物学活性相关的目的细胞和非目的细胞群，方法研究时应特别关注对照的设置与验证
    • 无菌和支原体检查法进行干细胞终产品的放行检测，必要时采用快速方法放行应进行方法学验证
  • 参比品/对照品
    • 鼓励开发建立细胞参比品用于干细胞产品的质量控制
    • 用于分析的参比品/对照品需具备代表性和可溯源性，应采用经验证的分析检测方法对其进行充分的特性分析，并鉴定合格
    • 需完成参比品/对照品标定（含量标定和活性标定）
    • 对产品开发各个阶段使用的参考品开展稳定性研究，确定复验期和有效期
• 对于逆转录病毒和非特定病毒因子检测，可参考《中国药典》三部通则“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的相关要求进行
• 质量研究
  • 研究对象的选择
    • 批次选择
      • 选择代表性的生产批次：非临床研究批次、临床试验批次、商业化生产批次
    • 生产阶段
      • 原代细胞或细胞种子、细胞库、工艺中间品、原液和制剂成品
  • 质量属性的选择
    • 细胞特性分析
      • 细胞形态
      • 细胞鉴别
        • 议从细胞的表型或遗传型等多种维度，采用种属鉴别和细胞谱系等多种方法对细胞进行鉴别
      • 细胞活性
        • 通过细胞活率、活细胞数、群体倍增时间(PDT)、细胞周期等对细胞活性进行综合评价
      • 生物标志物
        • 鉴别范围
          • 细胞类型、多能性、谱系、终末分化和/或功能
        • 检测方法
          • 如蛋白免疫印迹（Western Blot,）、流式细胞术、免疫荧光等
        • mRNA 标记物与蛋白质标记物表达的有效相关性如果经验证，可使用基于 mRNA 的标记物辅助进行细胞表征。
    • 理化特性分析
      • 常包括外观、颜色、pH 值、明显可见异物、渗透压摩尔浓度、装量等
      • 结合产品类型和制剂特征开展研究
    • 纯度和杂质分析
      • 纯度
        • 活细胞比例
        • 细胞群或亚群比例
        • 目的细胞比例和非目的细胞比例
          • 当非目的细胞对产品安全性和有效性无不良影响时，需研究其组成和比例，尽量控制批间一致性
        • ……
      • 杂质
        • 工艺相关杂质
          • 生产过程中引入的杂质，如残留的外源蛋白、抗生素、诱导试剂、微载体、病毒载体、DNA 等
        • 产品相关杂质
          • 非目的细胞、细胞非预期表达的产物、死细胞残留、细胞碎片和其他可能的降解产物等
      • 要求
        • 影响产品安全性的杂质
          • 在工艺中予以去除，在质量研究中予以检测，并进行定性/定量控制
        • 高风险杂质（如 ESC 或 iPSC 残留）
          • 建立和明确杂质去除方法及杂质残留的定量检测方法
        • 不能有效去除的杂质
          • 当在动物模型或其他系统中进行安全性和毒性评估，并根据人体暴露最大剂量或体内安全性研究结果，设定安全合理的残留限度
    • 安全性分析
      • 生物学安全性
        • 成瘤性，致瘤性
        • 非预期分化
          • 研究、评估和监控干细胞产品非预期分化的可能性和影响
        • 脱靶编辑
      • 微生物学安全性
        • 微生物：细菌、真菌、支原体和病毒
        • 微生物代谢物/衍生物：内毒素
        • 病毒
          • 种属特异性病毒：人源/动物源病毒
          • 内外源逆转录病毒
          • 其他非特定病毒
    • 生物学活性分析
      • 开发能够代表产品作用机制的定量生物学活性/功能测定方法，多活性组分产品应当分别进行鉴定和活性测定
      • 开发干细胞生物学活性的替代指标
      • 评估产品的免疫化学、生物化学和/或分子属性来提供广泛的产品表征数据
      • 采用的分析测定法应开展替代方法与活性相关性研究，还应证明该测定法可以区分活性产品与非活性或降解形式的产品，并进行充分的对照研究和方法学验证
      • 有些干细胞产品具有复杂的和/或不完全清晰的作用机理或具有多种生物学活性，细胞生物学功能表征须结合体外生物学效应和体内动物模型综合评价。
• 质量研究与质量标准
• 工艺验证
  • 产能
    • 考虑人员、设备、物料、环境、检测等整体运行能力对生产产能的支持能力
    • 着重考虑干细胞的体外扩增能力、代次和分化效率、产品纯度对商业化生产产能的支持能力
  • 质量
    • 详细记录工艺验证中，不同批次工艺性能和产品质量的变化情况，全面确认生产工艺的稳健性和产品质量的一致性
    • 验证关键生产阶段样品的鉴别、微生物安全性、纯度和生物学活性，评估基因组稳定性等，确保产品的安全性
  • 传代稳定性
    • 必要性
      • 到生产工艺对生产终末细胞的影响，需对可传代的终产品进行传代稳定性研究和验证
    • 关注点
      • 注限传代次下的生长特性稳定性、遗传稳定性、成瘤/致瘤性考察以及终末细胞分化和去分化情况分析等
  • 临川前回输
    • 使用前操作
      • 运输方式
      • 在医院的使用方法（复苏、洗涤）
      • 处理时间
      • 储存条件
      • 期限
    • 质量控制（风险）
      • 细胞失活、聚团、丧失干性等
      • 临床使用过程中微生物污染
    • 对于新型给药装置和给药方式，需验证给药准确度
• 工艺变更
  • 变更需研究的内容
    • 更前后的原材料比对、工艺过程比对、工艺中间品与终产品的质量属性比对，以及稳定性比对等
    • 质量属性比对应该着重关注鉴别、生物学活性以及纯度和杂质等
  • 参考原则
    • ICH Q5E
      • 设置合理的可比性研究取样点、检测指标及可接受标准，选用变更前后工艺生产的代表性批次进行可比性研究
• 工艺开发
  • 原液工艺
    • 细胞培养
      • 干细胞培养的风险
        • 被病原体污染的风险
        • 长时间传代可能会导致突变累积、基因组和表观遗传不稳定，从而改变细胞分化能力或功能，特别是因为变异的细胞可能会在培养中存在生长优势。
      • 工艺开发关注点
        • 严格选择合适的培养体系（培养基和添加因子）、培养方式，准确控制培养时间和培养代次
        • 采用有传代稳定性研究支持的传代代次内的干细胞制备终产品
    • 诱导分化
      • 为有效控制干细胞发生非目标分化，需采用合理的分化诱导剂或适当的分化抑制剂提高定向分化效率
      • 生产工艺应能对不同分化阶段的细胞命运进行有效调控，控制终末细胞不再发生非预期的分化或转分化
      • 对各阶段细胞群的组成、纯度、干性、多能性、分化潜能、标志物表达、生物学功能（分化能力和细胞因子分泌谱）等可选择在合理的分化节点进行监测
    • 基因修饰和其他
    • 纯化工艺
    • 生产工艺的设计应能避免细胞发生非预期或异常的变化，并能满足去除相关杂质和具备相应功能的要求。
  • 制剂工艺
    • 制剂处方
      • 处方组成
      • 制剂规格
      • 细胞浓度
    • 辅料
      • 明确辅料的来源、质量和用量
      • 使用应符合药典要求
      • 选择低风险、药用级辅料
      • 使用新型辅料应展开非临床安全性研究
    • 制剂生产工艺
      • 若制剂需要冻存，应开展制剂的冻存和复苏工艺研究
      • 对于冷冻保存或以其他方式储存的产品，应确定短期或者长期储存对产品活性和稳定性的影响
  • 工艺过程控制
    • 目的
      • 确保其质量(一致性、纯度和效力)和安全性
    • 控制范围
      • 工艺参数
        • 培养条件
          • 温度
          • 溶氧
          • pH
          • CO2
        • 工艺添加剂的用量
        • 生产中每个环节的时间控制范围
      • 中控标准
        • 细胞形态
        • 活力
        • 表型特征（包括预期和非预期细胞群）
        • 生物负载
        • 回收率
        • 微生物安全性指标(无菌、支原体、内毒素）
• 生产工艺
• 接触性耗材、容器和药械组合
  • 范围
    • 是指生产过程中与工艺中间品直接接触的耗材和容器（一次性管路、细胞工厂、生物反应袋、滤器等）
  • 需求
    • 需结合产品特点开展适用性和生物安全性评估，并进行相关研究
  • Note
    • 药械组合产品需关注各组件与样品的相互作用和风险，以及组件对干细胞产品功能的影响
• 生产用物料
• 原材料
  • 起始原材料
    • 生产用细胞
      • 要求
        • 来源应当稳定，且质量一致
      • 供者筛查
        • 防范病毒污染、组织排异、相关疾病等风险
        • 供者的病原微生物感染筛查方面，尤其对于同种异体供者，可参考采供血的相关要求
        • 应根据供者细胞类型、供者健康/疾病史或区域流行病区旅居、细胞/组织特异性的易感病原体等具体情况适当增加相应的筛查项目，并列入验收标准
        • 病原微生物检测
          • 供者筛查应尽可能采用监管机构批准的血源筛查试剂盒检测病原体
          • 对于无血源筛查试剂情况下，可采用已批准的体外诊断试剂，检测方法应经过适用性确认，关注检测方法灵敏度对病原微生物的检出能力
          • 如无批准的检测方法或产品，可以采用经过全面方法学验证的自建方法
        • 结合先进的分析检测技术充分评估受者被引入疾病的潜在风险，如对异体供者进行致病基因方面的检测
      • 供者组织和细胞质量
        • 需关注的关键质量特性：细胞鉴别、活率及生长活性、外源致病微生物和干细胞特性检测（如细胞表面标志物群、表达产物和分化潜能等）
      • 细胞建系与建库
        • ESCs/iPSCs细胞库检定内容一般包括：细胞形态、鉴别、活性、标志物，细胞干性/多能性（如多能性基因 OCT4、SOX2、NANOG 等检测，三胚层方向的分化标志物检测、畸胎瘤试验）、分化潜能，微生物学安全性、杂质残留、遗传稳定性（染色体稳定性如核型或数字核型分析、全基因组测序、全外显子测序）和表观遗传学研究等。
      • 传代稳定性
        • 细胞代次：建议以群体倍增水平（PDL）定义细胞代次，或明确细胞传代过程中的群体倍增时间（PDT）以开展研究
        • 重点关注：遗传稳定性、成瘤/致瘤性、细胞干性、多能性、目的细胞分化能力等
        • 研究项目：细胞形态、STR 鉴别、活率、活细胞数、群体倍增时间、表型等生长特性稳定性，也包括染色体核型和组学测序等遗传稳定性，还包括多能性基因表达、畸胎瘤形成、定向诱导分化等干性的稳定性。
    • 生产辅助细胞
      • 分类：病毒包装细胞、饲养层细胞
      • 必要性说明：应充分说明其使用的必要性与合理性
    • 体外基因修饰系统
  • 其他原材料
    • 分类
      • 培养基
      • 细胞因子
    • 必要性说明
      • 需充分考虑原材料使用的科学性和安全性，以及大规模生产时的持续可及性
    • 质量要求
      • 应有明确的来源、组成、用途、用量和质量控制
      • 具备原材料来源证明、检验报告书、包装说明书、TSE/BSE风险分析等文件
      • 优先选择质量标准级别高、风险等级低的原材料，若生产中使用研究级试剂（如培养基、细胞因子、化学小分子等），为了确保产品一致性和纯度，应尽可能按照GMP要求生产。如果对未按照GMP生产的试剂是否具备足够高的质量应用于人体存在疑问，应有足够的研究资料去除这种疑问
    • 细胞制备过程中不得使用青霉素等β-内酰胺类抗生素
    • 对于可能影响产品安全性的原材料，若经评估对产品安全性无影响，需在最终产品或生产的合适阶段对残留进行评估和控制，并结合临床使用剂量确定需要控制的残留限度。有些高风险原材料可能需要单独开展动物体内的安全性评估。
• 干性胞产品性质
  • 生物学活性（关键质量属性）
    • 应考虑因素
      • 特异性标志物
      • 适用于大规模生产的筛选和鉴定方法
      • 产品批间的分化效率、均一性
      • 功能性细胞的验证策略
    • 需收集数据
      • 分子、生化、免疫学、表型、物理和生物学特性
  • 定向分化和非预期生物学效应
    • 分化策略参数
      • 诱导或抑制材料
      • 诱导或抑制材料剂量
      • 添加顺序
      • 维持时间
      • 终点残留量
    • 影响因素
      • 分化效率
      • 产品质量
      • 产品安全
        • 非目的细胞等杂质
        • 细胞在加工后发生非预期变化
        • 受迁移至体内局部微环境影响导致的非预期生物学效应
    • 解决方式
      • 产品的分化阶段的监测
        • 胚层的基因标志物
      • 确定合理的标志物检测体系
      • 预防控制由于非定向分化而产生的非预期生物学效应
  • 成瘤性和致瘤性
    • 相关风险因素
      • 复杂的制备工艺、长时间的细胞传代和离体操作
      • 干细胞产品中可能残留未分化细胞、非预期分化细胞、恶性转化细胞、突变
      • 细胞培养过程中的遗传和表观遗传变异/不稳定性
      • 基因修饰可能引入的高风险基因元件以及基因/病毒载体插入所导致的致癌基因活化或抑癌基因失活等
  • 多能干细胞残留
    • 风险因素
      • 畸胎瘤、其他错误模式肿瘤或癌前病变
    • 控制策略
      • ESCs/iPSCs 细胞系选择
      • 高效定向分化
      • 严格纯化
      • 开发检测最终产品中未分化多能干细胞污染的敏感检测方法
    • 技术方法
      • 核型分析
      • 全基因组和表观遗传组水平的综合分析及风险分析
  • 遗传和表观遗传学研究
    • 结合细胞特性，在合适阶段对过程样品或终产品进行遗传和表观遗传的稳定性评估
      • 基因突变分析
      • 去乙酰化检测
      • ……
    • 干细胞产品的基因组突变以及遗传病有关的基因突变等风险
      • 测序方法
  • 其他问题
    • 风险因素
      • 不同供者、同一供者不同组织来源的细胞具有较大的差异性
      • 细胞培养过程中可能不得不添加人源/动物源材料，操作过程中可能引入的外源因子，均存在污染和交叉污染的风险。对于异体产品，更需关注外源因子引入或传播的风险。
      • 产品批次数据积累有限，关键工艺参数（CPP）和关键质量属性（CQA）认知有限。
      • 产品可能发生多轮工艺变更，产品质量无法完全精确表征
    • 控制策略
      • 生产环境
        • 建立清场和隔离操作规范，并尽量采用连续、密闭式设备、设施，减少生产过程中的环境暴露环节
      • 原材料
        • 持续进行供者材料和细胞库的资格鉴定及适用性评估
        • 关注替代细胞库的再生产
        • 做好细胞库和工艺中间品的稳定性研究
        • 对其他原材料供应商进行评估、审核，对不得不用的人源/动物源原材料严格质控
      • 生产工艺和过程控制
        • 建立完善的可追溯系统
        • 关注生产过程中的细胞鉴别检测
        • 做好上下游材料批号和标识管理
        • 加强对细胞库和未处理收获液的分析检测
        • 生产关键节点，对样品的有关检项均应符合要求
          • 无菌、内毒素、支原体、内外源病毒
        • 明确合理的过程控制指标和废弃指标
        • 对工艺中间品进行检定或质量监测
      • 质量研究和质量控制
        • QbD
        • 应尽早开展产品和工艺的表征，以及分析检测方法的开发
        • 对产品进行全面的质量特性分析和数据收集
        • 加强对产品关键质量属性的合理判断
        • 由于这类产品往往难以精确表征，可通过加强原材料控制、过程控制和工艺中间品的检测来补充放行检测
      • 稳定性
• 在干细胞产品的生产工艺设计与验证、质量研究和控制、稳定性研究等研发过程中，应对以上各个环节的干细胞特性进行充分考虑。
• 干细胞产品概述
  • 特点
    • 具备自我更新和多向分化潜能
  • 产品类型
    • 干细胞产品的细胞类型多样，产品细胞本身具备体内生存、增殖和/或分化、细胞间相互作用等能力
  • 生产流程
    • 供者材料的获取、运输、接收，细胞系/库建立与检定，生产、检验、放行、储存和运输等
• 干细胞产品特点
• 子主题
• 细胞
  • 起源
    • 人成体（干）细胞
    • 人胚胎干细胞
    • 诱导多功能干细胞
  • 工艺
    • 扩增
    • 基因修饰
    • 诱导分化
    • 转（分）化
  • 中间产品
    • 干细胞及其衍生细胞
  • 终产品
    • 加入制剂辅料，分装至特定容器，并符合特定药品放行标准，可直接应用,也可与组织工程材料组合应用于临床的治疗产品
• 人源干细胞产品定义