高中生物选修三基因工程

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基因工程

• 概念
  • 基因工程是按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
• 原理
  • 基因重组
• 设计施工
  • DNA分子水平上
    • 因此又称“DNA重组技术”
• 工具
  • 限制酶
    • 来源
      • 原核细胞
    • 功能
      • 识别特定脱氧核苷酸序列，切割特定磷酸二酯键
    • 结果
      • 形成粘性末端或平末端的DNA片段
  • DNA连接酶
    • 功能
      • 连接具有相同黏性末端或平末端的DNA片段，形成磷酸二酯键
    • 种类
      • E•coliDNA连接酶（大肠杆菌）
        • 只能连接相同的黏性末端
      • T4DNA连接酶（T4噬菌体）
        • 既能连接相同的黏性末端，又能连接相同的平末端
  • 载体
    • 功能
      • 将外源基因送入受体细胞
    • 种类
      • 质粒
        • 本质: 小型环状DNA
      • λ噬菌体衍生物
      • 动植物病毒
    • 条件
      • ①能自我复制
      • ②具有一个至多个限制酶切割位点 ——（供外源DNA片段插入）
      • ③具有标记基因
• 步骤
  • 获取目的基因
    • 基因文库
      • 基因组文库（国家图书馆）
        • 有启动子、内含子
      • 部分基因文库（cDNA文库）
        • 无启动子、内含子、终止子（物种间可以基因交流）
    • PCR技术
      • 名称
        • 多聚酶链式反应
      • 原理
        • DNA双链复制
      • 实质
        • 体外DNA复制
      • 前提
        • 有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物
      • 过程
        • 高温变性 → 低温退火 → 延伸子链 （90-95°） （55-60°） （70-75°）
          • Taq酶（热稳定性高）
      • 结果
        • 2ⁿ个DNA片段（至少循环3次才可获得）
          • （扩增n次，需引物2ⁿ - 1）
    • 人工合成
      • 前提
        • 目的基因较小，核苷酸序列又已知
      • 仪器
        • DNA合成仪
      • 方法
        • 逆转录法（已知mRNA）
        • 化学合成法（已知蛋白质氨基酸序列）
  • 构建表达载体
    • 目的
      • 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可遗传给下一代，同时能表达和发挥作用
    • 组成
      • 目的基因
        • （控制特定性状）
          • 主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子
      • 启动子
        • （RNA聚合酶识别和结合部位，启动目的基因转录出mRNA）
      • 终止子
        • （终止转录过程中的序列）
      • 标记基因
        • （鉴别受体细胞中是否含有目的基因）
      • 复制原点
  • 导入受体细胞
    • 转化
      • 目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程
    • • 植物
        • 农杆菌转化法（双子叶、裸子植物）
          • 体细胞，两拼接两导入，☆植物组培
            • （因为植物受到损伤后会分泌酚类化合物）
        • 基因枪法（单子叶植物）
          • 我国独创， eg.转基因抗虫棉，☆植物组培
        • 花粉管通道法（被子植物）
          • 成本高
      • 动物
        • 显微注射法
          • 受精卵，☆早期胚胎培养，胚胎移植
      • 微生物
        • 感受态细胞法（Ca²ˇ转化法）
          • 原核生物（大肠杆菌、酵母菌）
            • tips: 感受态细胞的细胞壁通透性增加，容易吸收周围环境中的DNA
  • 目的基因的检测与鉴定
    • 分子检测
      • 染色体DNA上是否插入了目的基因
        • DNA分子杂交技术
          • 提取转基因生物基因组DNA→使探针和基因组DNA杂交→是否出现杂交带
      • 目的基因是否转录出mRNA
        • 分子杂交技术
          • 提取转基因生物mRNA→使探针和mRNA杂交→是否出现杂交带
      • 目的基因是否翻译成蛋白质
        • 抗原-抗体杂交技术
          • 提取转基因生物的蛋白质→用相应抗体进行抗原-抗体杂交-是否出现杂交带
    • 个体生物学水平鉴定
      • 抗虫或抗病接种实验
      • 活性比较实验
• 应用
  • 转基因植物
    • 提高农作物抗逆能力；
      • 改良农作物品质；
        • 利用植物生产药物
  • 转基因动物
    • 提高动物生长速度；
      • 改善畜产品的品质；
        • 生产药物；
          • 作器官移植供体
  • 基因工程药物
    • 受体细胞
      • 多为原核生物
    • 方式
      • 基因工程培育“工程菌”生产药物
    • 成果
      • 白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗...
  • 基因治疗
    • 类型
      • 体外基因治疗、体内基因治疗
    • 基因种类
      • 正常基因、反义基因、自杀基因，
    • △
      • 并没有改变其生殖细胞的基因，所以治好了也不排除后代会患病
• 蛋白质工程
  • “第二代基因工程”
  • 原理
    • 改造基因（基因修饰/基因合成）
  • 优点
    • 可生产自然界没有的蛋白质
• 天然蛋白质: 遵循中心法则
• questions
  • 为啥不同物种基因能重组？
    • DNA结构基本相同
  • 为啥基因能在不同种的生物体内表达？
    • 不同生物共用一套密码子
  • 为啥同种限制酶切了能链接？
    • 能产生相同的黏性末端或平末端
  • 为啥不同种限制酶切后有的也能连接？
    • 能互补配对
• 遵循中心法则的
  • 〔天然蛋白〕 DNA → RNA → 蛋白质
  • 〔HIV〕 RNA → DNA → RNA → 蛋白质
  • 〔烟草花叶病毒〕 RNA → 蛋白质
  • 〔浆细胞〕 DNA → RNA →蛋白质(抗体)
• 为保证目的基因的表达，重组质粒上应含有特定的启动子，它能被受体细胞的RNA聚合酶所识别，以便于催化转录
• 将目的基因拼接到农杆菌Ti质粒的T-DNA片段（构建基因表达载体） ↓ 导入农杆菌（Ca+处理法） ↓ 导入植物细胞 ↓ 含目的基因的T-DNA整合到植物染色体DNA上 ↓ 稳定存在并表达
• tips
  • 基因探针
    • 放射性同位素或荧光标记的目的基因片段（单链）
  • 检测
    • 是否插入了目的基因
      • 目的基因是否稳定遗传的关键
    • 是否转录出mRNA
      • 检测是否发挥功能/表达的第一步
    • 是否翻译成蛋白质
      • 成功表达
• tips
  • 导入受精卵
    • ①受精卵全能性最大；②能发育成个体； ③能使目的基因在相应的组织中表达
  • 微生物做受体细胞
    • ①繁殖快；②多为单细胞； ③遗传物质相对少
  • 原核生物作受体菌
    • ①生产的蛋白不一定具有生物活性； ②不能成功表达来自基因组文库的目的基因
• 构建时要同2种限制酶切割目的基因和载体 →防止目的基因(载体)自连 ；防止目的基因和载体反向连接