DNA粗提取与鉴定

选修一生物DNA粗提取与鉴定核心知识点

DNA的粗提取与鉴定

• DNA提取原理
  • 提取生物大分子的基本思路
    • 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的大分子
  • 粗提取DNA的方法
    • 利用DNA与 RNA 、 蛋白质 和 脂质 等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分
• DNA的理化性质
  • DNA的溶解性
    • DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 NaCl溶液 中溶解度不同。利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的
      • 在0.14mol/L时，DNA溶解度最小
      • 在2mol/L浓度的NaCl溶液，DNA充分溶解
    • DNA不溶于酒精溶液
      • 细胞中的某些蛋白质则溶于酒精溶液
      • 利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离
    • DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
      • 对酶的耐受性
        • 蛋白酶能水解蛋白质，但是对 DNA 没有影响
      • 对温度的耐受性
        • 大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在 80℃ 以上才会变性
      • 对洗涤剂的耐受性
        • 洗涤剂能够瓦解 细胞膜，但对 DNA 没有影响
  • DNA的鉴定
    • 在沸水浴条件下，DNA遇 二苯胺 会被染成蓝 色，因此 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂
• 实验设计
  • 实验材料的选取
    • 选用DNA含量较高的生物组织
  • 破碎细胞，获取含DNA的滤液
    • 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可
    • 提取花椰菜的DNA时，在捣碎的花椰菜中加入一定的洗涤剂和食盐 ，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液
  • 去除滤液中的杂质
    • 用DNA在不同浓度的NaCl溶液中 溶解度 不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质
    • 直接在滤液中加入嫩肉粉，反应 10-15 min，嫩肉粉中的 木瓜蛋白酶 能够分解蛋白质
    • 将滤液放在60-75℃的恒温水浴箱中保温10-15min，注意严格控制温度范围。目的是除去担蛋白质等杂质
  • DNA的析出与鉴定
    • 将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的 二苯胺试剂
    • 混合均匀后，将试管置于 沸水浴 中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，观察溶解有DNA的溶液是否变蓝 。
• 操作提示
  • 制备生物血细胞溶液加柠檬酸钠静置或离心
    • 防止血液凝固
  • 加入洗涤剂后，动作轻缓，柔和，否则容易产生大量的泡沫 ，不利于后续步骤的操作
  • 加入酒精和用 玻璃棒 搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀
  • 二苯胺试剂要现配现用 ，否则会影响鉴定的效果