PCR技术

生物选修一PCR技术核心知识点

PCR技术

• 概念
  • PCR的全称为多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术
• 原理
  • DNA的复制原理
  • DNA的热变性原理
    • 在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性
    • 当温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性
• 条件
  • 原料
    • DNA
  • 模板
    • 加热变性解旋后的两条DNA母链
  • 酶
    • 耐热的DNA聚合酶
  • 引物
    • 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
      • DNA的两条链是反向平行的
      • DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸
        • 将DNA的羟基末端称为3′端
        • 磷酸基团的末端称为5′端
  • 其他条件
    • 缓冲溶液
    • 能够自动调控温度的仪器
• 过程
  • 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。
    • 变性
      • 当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
    • 复性
      • 当温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
    • 延伸
      • 当温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
  • 第一次PCR循环完成后，得到两个靶序列
• 结果
  • 产物种类
    • 主要看其DNA片段上的引物种类
  • 总数
    • 呈指数型扩增
• 实验操作
  • 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的 微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
  • PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存
  • 在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
  • 所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击离心管的侧壁，使反应液混合均匀
  • 混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部
• 优点
  • 原理虽然复杂，但操作简单
  • 快速，高效，灵活和易于操作