基因工程

高中生物选修三•现代生物科技专题•基因工程

基因工程

• 工具
  • 限制酶
    • 从原核生物中分离纯化，能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
    • 例如，EcoRⅠ，SmaⅠ限制酶
    • 产生末端
      • 黏性末端
      • 平末端
  • DNA连接酶
    • 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
    • E•coli DNA连接酶，来自大肠杆菌，只连接互补的粘性末端
    • T4 DNA连接酶，来自T4噬菌体，连接平末端的效率低于连接粘性末端
  • 载体
    • 例如
      • 质粒：是一种裸露的、结构简单、独立与细菌拟核DNA外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子
        • 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
      • λ噬菌体的衍生物
      • 某些动植物病毒
    • 条件
      • 能在宿主细胞内自我复制并稳定的保存
      • 有一个或多个限制酶切割位点，可以使外源基因插入其中
      • 具有某些遗传标记基因，以便筛选
      • 对受体细胞无害，易从宿主细胞回收
• 基本操作
  • 目的基因的获取
    • 基因文库
      • 基因组文库
      • 部分基因文库，如cDNA文库
    • PCR技术扩增
      • 90～95℃，DNA解链
      • 55～60℃，引物结合到互补链
      • 70～75℃，Taq酶从引物起始进行互补链的合成
    • 化学方法人工合成
  • 基因表达载体的构建
    • 目的：使基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用
    • 组成
      • 目的基因
      • 启动子
      • 终止子
      • 标记基因
  • 目的基因导入受体细胞
    • 基因工程常用大肠杆菌、枯草杆菌、动植物细胞，不用支原体（支原体致病）
    • 植物
      • 农杆菌转化法：适用于双子叶植物与裸子植物
      • 基因枪法/微弹轰击法：一般用于单子叶植物
      • 花粉管通道法
    • 动物：显微注射法
    • 微生物：如大肠杆菌，先用Ca离子处理使其成为感受态细胞，将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程
      • 由于原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，基因工程早期常用原核生物作为受体细胞，以大肠杆菌的应用最为广泛
  • 目的基因的检测与鉴定
    • 分子水平（检测）
      • DNA分子杂交
        • 将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中
      • DNA与mRNA分子杂交
      • 抗原抗体杂交
    • 个体水平（鉴定）
      • 抗虫、抗病的接种实验
      • 与天然产品的功能进行活性比较
• 应用
  • 植物
    • 引起植物生病的微生物成为病原微生物，主要有病毒、细菌和真菌等
    • 抗虫
      • Bt毒蛋白基因
      • 蛋白酶抑制剂基因
      • 淀粉酶抑制剂基因
      • 植物凝集素基因
    • 抗病
      • 病毒外壳蛋白
      • 病毒的复制酶基因
    • 抗真菌
      • 几丁质酶基因
        • 几丁质为真菌细胞壁成分
      • 抗毒素合成基因
    • 抗逆
      • 渗透压调节基因
        • 提高植物的抗盐碱和抗干旱的能力
      • 抗冻蛋白基因
      • 抗除草剂基因
    • 改善植物的品质
      • 将必须氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物，或改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量
      • 将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，获得转基因延熟番茄
      • 将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变化，提高花卉的观赏价值班
      • 科学家正计划培育一种发光的夹桃竹，将其种植到高速公路两侧
  • 动物
    • 提高生长速度：外源生长素基因
    • 改善畜产产品品质：乳肠糖酶基因
    • 生产药物：药用蛋白基因+乳糖蛋白基因的启动子等调控组件
      • 称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器
    • 作为器官移植供体：导入某种调节因子以抑制抗原决定基因的表达或设法除去供体的抗原决定基因
  • 基因工程药物：利用转基因工程菌生产药物，这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗、激素等
  • 基因治疗：将健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。【注意，并非把健康的外源基因导入患者的所有细胞中，只是导入某些功能细胞中，且是体细胞】
  • 基因芯片：通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针）有规律的排列固定与2平方厘米的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，可用于基因测序，寻找有用的目的基因，或对基因的序列进行分析
• 蛋白质工程
  • 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是基因结构
  • 以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要
  • 目的：生产符合人们生活需要的并非自然界已存在的蛋白质
  • 基本途径：从预期的蛋白质功能出发—设计预期的蛋白质结构—推测应有的氨基酸序列—找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）
  • 进展和前景
    • 科学家通过对胰岛素的改在，使其成为速效型药品
    • 用蛋白质工程制成的电子元件具有体积小、耗电少、效率高的特点，极有广阔的发展空间
• 干扰素是一种人体细胞或动物受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。而糖蛋白需在内质网、高尔基体内合成，故糖蛋白不可在原核生物如大肠杆菌体内合成，可在真核生物如酵母菌体内合成。
• Q：确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因 A：根据人类的需要改造后，通过人工合成的方法或从基因库中获取