读书笔记

免疫原和抗体的制备读书笔记 思维导图，免疫原是能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。

免疫原和抗体的制备

免疫血清的制备

多克隆抗体PcAb

免疫动物的选择、免疫方法

免疫血清的采集

免疫血清鉴定合格后，在末次免疫后5~7天及时采血

颈动脉放血法：家兔、绵羊；静脉多次采血法：家兔耳缘静脉、绵羊颈静脉；心脏采血法：豚鼠、大鼠、鸡

血清分离：血液室温凝固1-2h或4℃过夜，3000r/15min离心，4℃冷藏

免疫血清的纯化、鉴定与保存

纯化

特异性抗体纯化：亲和层析法、吸附剂方法

IgG类抗体纯化：①盐析法粗提γ球蛋白：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐层析法②离子交换层析法：离子交换剂QAE-葡聚糖凝胶③亲和层析法

纯化的IgG含量少，应及时应用或冻干保存，加入三乙醇胺或甘油保护

鉴定

1、效价的测定：双向免疫扩散实验、ELISA 2、特异性鉴定：双向免疫扩散实验 3、纯度鉴定：SDS-PAGE 4、亲和力鉴定：ELISA

保存

4℃+0.1%~0.2%NaN3，三到六个月

-20℃+50%甘油/-80℃，五年

冷冻干燥，长期保存

单克隆抗体的制备

杂交瘤抗体技术

原理：致敏B细胞+骨髓瘤细胞→杂交瘤细胞

原则： 1、抗体产生的克隆选择学说：一种克隆产生一种抗体；2、杂交瘤细胞保持双方亲代细胞的特性；3、利用代谢缺陷补救机制筛选出杂交瘤细胞，克隆化。

亲本细胞选择：①骨髓瘤细胞：不分泌Ig或细胞因子、细胞株稳定HGPRT缺陷（次黄嘌呤﹣鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）、B细胞融合形成稳定的杂交瘤 ②常用细胞株：Balb/c小鼠骨髓瘤NS-1和Sp2/0细胞株 ③致敏B细胞：与骨髓瘤细胞同源脾细胞

细胞融合

筛选与克隆

HAT培养基：次黄嘌呤、氨甲嘌呤、胸腺嘧啶，筛选，克隆

冻存、鉴定

慢冻快融 冻存液：70%RPMI1640+20%FCS+10%DMSO

批量生产与纯化

生产：动物体内诱生法、体外培养法

纯化:亲和纯化法

单克隆抗体特性：只是别单一相同抗原表位、特异性高、抗体均一、应用广泛、尤其是标记免疫技术

基因工程抗体的制备

人源化抗体、小分子抗体、双特异性抗体、抗体融合蛋白、抗体库技术

免疫原的制备

概念

免疫原是能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原

颗粒性免疫原制备

种类

细胞抗原、细菌抗原、寄生虫抗原

细胞抗原

绵羊红细胞制备

细菌抗原

H抗原、O抗原、Vi抗原

可溶性抗原制备

组织和细胞的破碎

组织匀浆的准备

新鲜、低温（-40℃以下）保存

组织细胞或培养细胞破碎

反复冻融法

超声波破碎法

酶处理法

自溶法

冷热交替法

表面活性剂处理法

可溶性免疫原的粗提

高速离心

可溶性免疫原的提纯

制备超速离心法

分离细胞、亚细胞、生物大分子

分离较大颗粒 差速离心法

甘油、蔗糖、氯化铯 密度梯度离心法

选择性沉淀法

盐析剂是33%~50%饱和度的硫酸铵 盐析沉淀法

乙醇、丙醇 有机溶剂沉淀法

聚乙二醇、硫酸葡萄糖 水溶性非离子型聚合物沉淀法

核酸沉淀法

凝胶过滤法

离子交换剂：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖、离子交换树脂 离子交换层析法

效率高、特异性最强、纯度最高 亲和层析法

等电凝胶电泳、SDS-PAGE 电泳法

解离二硫键法、解离非共价键法、断裂肽键法 免疫球蛋白片段的制备

纯化免疫原的鉴定

蛋白质含量测定、纯度鉴定、相对分子质量鉴定

双向免疫扩散法、免疫电泳法、ELISA 免疫活性鉴定

人工免疫原的制备

半抗原+载体 人工结合免疫原

载体常用牛血清白蛋白，连接：物理吸附、化学法（戊二醛法、混合酸酐法 、碳化二亚胺法 载体与连接

20个以上的半抗原分子连接到一份载体分子上才能有效的诱导机体产生抗体 鉴定

免疫佐剂

弗氏佐剂

不完全弗氏佐剂由液体石蜡+羊毛脂，完全弗氏佐剂由液体石蜡+羊毛脂+卡介苗/死的分枝杆菌