核酸实时定量检测技术

临床分子生物学检验技术第六章，内容有实时荧光定量PCR技术(Q-PCR)、Q-PCR的基本原理、Q-PCR引物和探针的设计、Q-PCR反应体系和条件的优化、Q-PCR测定的数据分析。

核酸实时定量检测技术

• 实时荧光定量PCR技术（Q-PCR）
  • 概念：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCCR反应进程，最后通过相关数据分析方法对目的基因进行定量分析的技术。
  • 与常规PCR区别
    • 1.反应体系 常规PCR：五要素； Q-PCR：六要素(荧光基团：实时检测产物的生成)
    • 2.反应条件 Q-PCR 每一循环结束多一步收集荧光(荧光曲线的来源)
    • 3.常规PCR是一个定性反应，Q-PCR可定量分析。
  • 常规PCR缺点
    • 问题1：由于受扩增效率、平台效应和检测系统等多种因素影响， 常规PCR不能对目的基因精确定量，常常是对其有无进行定性分析。
    • 问题2：产物分析时需要开盖操作，容易引起交叉污染，导致假阳性，限制其在临床上的应用。
  • Q-PCR与PCR比较的优势
    • 1.操作方便、快速、高效，具高敏感性、重复性和特异性。
    • 2.在全封闭的体系中完成扩增并进行实时分析，降低污染可能性，结果分析更加快捷方便，扩增后无需电泳处理。
    • 3.实现多重扩增（通过设计不同的引物在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增分析）。
• Q-PCR的基本原理
  • 常用概念
    • 扩增曲线（进行实时监测）
      • 横坐标：扩增循环数， 纵坐标：荧光强度， 每个循环进行一次荧光信号的收集。
    • 荧光阈值
      • 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，在指数扩增最初阶段的任意位置，一般是3~15个循环的荧光信号标准差的10倍。 突破Ct以后，荧光以指数形式增加，然后线性增加，并最终进入平台期。
    • 循环数（循环阈值）Ct值
      • 概念：PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经过的循环次数。
      • 每个模板的Ct值与起始模板量成反比
    • 扩增效率（E）
      • 概念：PCR反应一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值（值在0-1之间）1代表完全半保留复制。
      • PCR中， E值的变化趋势： 一般情况下，在PCR反应的前20~30个循环中，E值比较稳定为指数扩增期。Ct值应在此阶段考察。
  • PCR扩增的理论模式
    • 初始模板量的对数与Ct值之间存在反比线性关系(负相关) n=-klg Xo+b 较高的初始模板浓度有较低的Ct值。初始模板量越多，扩增产物达到值所需的ct值就越少。以上PCR理论仅在PCR指数扩增期才成立。
  • Q-PCR中的荧光化学物质
    • 前言
      • 荧光染科技术是一种非特异性的检测方法。
      • 荧光探针技术是基于荧光共振能量转移(FRET) 原理所建立的光定量PCR技术， 特异性荧光标记：Taqman探针。
    • 荧光染料技术（DNA交联荧光染料技术）（非特异检测）
      • 荧光原理
        • SYBR Green I（SGI）是一种可以非特异地结合双链DNA(d sDNA)小沟的荧光染料。SGI与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍。
          • SGI存在的问题 1.对PCR的抑制效应 2.荧光强度低 3.稳定性差
        • 在PCR反应体系中加入过量的SGI染料，游离的SGI几乎没有荧光信号，SGI选择性掺入dsDNA中， 产生很强的荧光信号。检测阶段：每个循环的延伸结束后。荧光信号与模板数成正比，PCR产物越多， 荧光信号越强。 1.热变性——SGI游离不发光 2.引物退火——与DNA结合后使其发光 3.延伸反应
      • 优点
        • 成本低
        • 操作简单——不必设计复杂探针
        • 对DNA模板没有选择性——适用于任何反应体系
      • 缺点
        • 非特异性—容易结合到非特异性扩增产生的双链分子或引物二聚体中， 产生假阳性
        • 对引物特异性要求较高
        • 解决方法
          • 熔解曲线
          • 选择合适的引物
          • 优化反应条件
    • 荧光探针技术（特异检测）
      • 前言
        • 基于荧光共振能量转移((FRET))原理的特异检测方法。
          • 一个处于激发态的能量供体与一个能量受体之间的能量转移。这种能量转移与供受体间的距离有关。通过改变供受体间的距离来控制荧光能量共振转移的发生和消失。
        • 选择合适的荧光基团和淬灭基团对核酸探针进行标记。利用了核酸探针的杂交或水解导致荧光基团与淬灭基团结合或分开(荧光共振能量转移产生或消除)来引入荧光信号
      • 水解探针技术（TaqMan探针技术）
        • 应用最广泛
        • TaqMan探针
          • 反应体系
            • 一对引物，一条荧光素标记的探针。
            • Taqman荧光探针为一寡核苷酸，中间序列是与模板目标序列特异结合的探针。两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。5’标记荧光报告基团（FAM、TET、HEX），3'末端标记淬灭基团（TAMRA）。由于荧光共振能量转移（FRET）原理，探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。
          • TaqMan加入PCR步骤，荧光信号扩增
            • 1.PCR过程中， 引物和探针与模板的特定序列结合。
            • 2.Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性，将探针水解从而破坏荧光基团和淬灭基团之间的FRET。
            • 3.照射报告基团发出可检测的荧光信号。
            • 4.随着PCR扩增的进行， 荧光信号不断积累，荧光的累积和PCR完全同步。
            • 5.检测阶段：每轮循环的延伸过程中。延伸过程中水解探针，消除FRET作用，被释放的荧光报告基团可被检测。
            • 第1个循环后，一个起始模板会释放1个荧光信号基团。 第2个循环后，3个荧光信号基团。 第n个循环，2n（幂）-1个荧光信号基团。
          • 优点
            • 高度的检测特异性，不需进行熔解曲线分析
            • 信噪比高
            • 可用于多重Real-Time PCR
          • 缺点
            • TaqMan探针只适合一个特定的目标靶基因
            • 探针合成成本高
            • TaqMan探针荧光淬灭不彻底
            • 容易受Taq DNA聚合酶5'-3'外切酶活性影响
          • 应用领域：病原体核酸检测商品化试剂（HBV、DNA检测）
        • MGBTaqMan探针（在TaqMan基础上改进）
          • 3'端连接一种非荧光性的淬灭基团（NFQ），吸收报告基团的能量后不发光，降低测定中的本底值。
          • 3'端还连接一个小沟结合分子，增强探针与模板的杂交，提高探针的Tm值，使较短的探针同样达到较高的Tm值，使报告基团与淬火基团的距离更接近，提高淬灭效率
      • 双杂交探针技术（TaqMan技术的延伸）
        • 反应体系
          • 一对扩增引物，两条荧光标记探针，其中一个探针的3'端标记供体荧光基团，另一探针5'端标记受体荧光基团。3'端必须封闭防止其作为引物扩增。
        • 步骤
          • 当探针与模板互补后，两个探针相邻(仅相差1-5个碱基)使供体荧光基团与受体荧光基团相互靠近，激发供体荧光基团后，由于荧光共振能量转移，可使受体荧光基团发荧光。
          • 检测阶段：每轮循环的退火阶段。
          • 荧光信号扩增：相邻探针与模板退火后， 通过FRET作用产生荧光信号检测模板的数目。 一条双链DNA模板给出1分子荧光信号。 第1个循环的退火阶段，一个起始模板会释放1个荧光信号基团。 第2个循环的退火阶段，2个荧光信号基团。 第n个循环的退火阶段，2（n-1）（幂）个荧光信号基团。
        • 优点
          • 特异性强（两个探针都必须结合到正确的目的序列时，才能检测到荧光）
        • 缺点
          • 成本高（需合成两条探针）
      • 分子信标技术（TaqMan技术的延伸）
        • 分子信标
          • 分子信标是一段荧光标记的单链寡核苷酸探针，由两部分组成，一部分是环状区，能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列，是检测靶基因的部分，位于探针的中间部分。另一部分是柄区，分别在5'和3'端的荧光物质和荧光淬灭物质，探针5'和3'端有几个互补的碱基存在，因而可形成两端反转配对，构成探针的茎部。
        • 工作原理
          • 根据FRET原理和碱基互补原则。
          • 检测阶段：每轮循环的退火阶段。
          • 荧光信号扩增：分子信标探针与模板退火， 消除FRET作用产生荧光信号检测模板的数目，一条双链DNA给出1分子荧光信号。同双杂交探针技术。
        • 优点
          • 背景信号低
          • 灵敏度高
          • 特异性强
          • 操作简便
        • 缺点
          • 实验结果的稳定性不高（茎环结构在PCR反应变性时有时不能完全打开，探针不能完全与靶基因结合。）
          • 难，成本高
        • 适用领域：基因突变分析、活细胞内核酸的动态检测、DNA/RNA杂交的动力学研究、DNA/蛋白质相互作用研究
    • 数字PCR技术（ddPCR）
      • Vogelstein和Kinzler提出，目前最新的核酸分子绝对定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量。采用染料法和水解探针法检测。
        • 微流控——芯片的微反应器
        • 微滴化——微滴
        • 一个反应器中含有的待测分子数不会超过1个。
      • 适用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（等位基因不平衡表达）、单细胞基因表达分析。
      • 特点
        • 1.有限稀释
        • 2.终点PCR
        • 3.采用绝对定量的方式（直接计数或泊松分布）
        • 4.不受扩增效率的影响
        • 5.不依赖于标准曲线和参照样本
        • 6.直接检测目标序列的拷贝数
• Q-PCR引物和探针的设计
  • 实时定量PCR引物设计的基本原则
    • 1.最适长度15~20bp，GC含量在45%~55%。
    • 2.TaqMan引物的Tm最好在68~70℃； 分子信标和双杂交探针相关引物的Tm值变化区间可大一些，但相互应接近。
    • 3.引物的3'端最好不为G或C，3'端不应出现2个G或C。用SGI时，避免出现明显的引物二聚体。
    • 4.扩增片段的长度SGI≤300bp；TaqMan≤400，50~150bp。
  • 实时定量PCR探针设计的基本原则
    • 1.绝对保守
    • 2.TaqMan探针长度、Tm值。
    • 3.5'端不能含有G，防止淬灭荧光报告基团而产生假阴性。
    • 4.3'端必须封闭。
    • 5.重复碱基要避免。
    • 6.TaqMan探针与引物的位置关系。
    • 7.避免探针与引物之间形成二聚体。
    • 8.分析mRNA表达时，探针的位置外含子/外含子边界?
    • 9.TaqMan探针检测等位基因或突变位点时的设计原则：错配碱基位于中间，探针尽可能短。
• Q-PCR反应体系和条件的优化
  • 优化目的
    • 保证高的扩增效率，保证RT-PCR结果的精确性和稳定性。
  • 具体优化方法
    • 1.模板的质量与浓度：保证Ct值位于15-30。
    • 2.引物和探针的浓度.
    • 3.Mg2+浓度:2~5mM.
  • 实时定量PCR反应条件的优化
    • 1.退火温度
    • 2.循环次数
• Q-PCR测定的数据分析
  • 绝对定量
    • 用已知的标准曲线来推算未知的样本量。
    • 如何通过绝对定量法计算实时荧光定量PCR反应中的起始模板的数量?
      • 1.以样品和已知浓度标准品为模板设置FQ-PCR反应体系，以荧光染料技术或荧光探针技术引入荧光基团实时监测PCR；
      • 2.制作FQ-PCR的扩增曲线；
      • 3.由扩增曲线获得样品和已知浓度标准品的循环阈值(Ct)；
      • 4.根据标准品的浓度对数值和其对应Ct值制作标准曲线，获取线性方程式；
      • 5.根据样品的Ct值和标准曲线线性方程式计算起始模板的数量。
  • 相对定量
    • 利用内参基因，推算在一定样本中的目的基因表达量相对于另一参照样本中该基因的表达量的变化。
    • 如何使用相对定量法对起始模板定量? 通过检测靶基因相对于内参基因的表达变化来是实现的。 ?
      • 标准曲线法的相对定量（双标准曲线法的相对定量）：利用已知相对稀释度的靶基因和内参基因标准品。
      • 比较Ct法的相对定量（△△Ct）：相对表达量(实验组/对照组)=2-△△Ct目的基因（幂）