《生物化学与分子生物学》第一章：蛋白质

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蛋白质

• 分子组成
  • 氨基酸
    • 元素组成
      • 常量元素：C、H、O、N、（S）
      • 微量元素：磷、铁、铜、锌、锰、钴、钼、碘
      • 含氮量接近16%
        • 凯氏定氮法
    • 旋光性
      • L-α-氨基酸（除甘氨酸外）
        • 氨基在左侧为L型 连在羧基上的碳称为α-碳原子
    • 分类
      • 非极性脂肪族氨基酸
        • R基为脂肪烃 溶解度小于极性中性氨基酸
      • 极性中性氨基酸
      • 芳香族氨基酸
        • 侧链有疏水性苯基
        • 苯丙氨酸（Phe）
        • 酪氨酸(Tyr)
        • 色氨酸(Trp)
      • 酸性氨基酸
        • 侧链是羧基 等电点低
        • 天冬氨酸（Asp）
        • 谷氨酸（Glu）
      • 碱性氨基酸
        • 等电点高
        • 精氨酸（Arg）
        • 赖氨酸（Lys）
        • 组氨酸（His）
    • 特殊记忆
      • 脯氨酸：亚氨基酸
      • 半胱氨酸：极性最强，脱氢形成胱氨酸（二硫键连接）
      • 含羟基氨基酸：丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸
      • 丙氨酸等电点6.00
      • 鸟氨酸、瓜氨酸不编码蛋白质，参与合成尿素
    • 特性
      • 两性解离
        • 等电点
        • “酸正碱负”
          • pH高于pI，氨基酸带负电
          • pH低于pI，氨基酸带正电
        • pI=1/2*（pK1+pK2）
      • 含共轭双键氨基酸能吸收紫外线
        • 可见光波长：400～760nm 紫外线波长：＜400nm 红外线波长：＞760nm
        • 共轭双键
        • 最大吸收峰在280nm
          • 紫外光分光光度计
        • 紫外线吸收度：色氨酸＞酪氨酸＞苯丙氨酸
      • 氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物
        • 蓝紫色最大吸收峰在570nm
          • 可见光分光光度计
  • 肽
    • 相关概念
      • 肽键：连接两个氨基酸的酰胺键是肽键，其中C-N键有双键特性
      • 寡肽：2～20个氨基酸相连而成的肽
      • 多肽：20个以上氨基酸相连而成的肽
      • 氨基酸残基：肽链中氨基酸分子因脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基
      • 蛋白质：由许多氨基酸残基组成、折叠成特定的空间结构、并具有特定生物学功能的多肽（氨基酸残基数通常＞50）
    • 重要化学键
      • 肽键
    • 谷胱甘肽（GSH）
      • 组成：由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽
      • 功能基团：半胱氨酸中的巯基
      • 功能
        • 巯基具有还原性；保护体内蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使蛋白质或酶处在活性状态。
        • 巯基具有嗜核特性；能与外源的嗜电子毒物如致癌剂或药物结合，阻断这些化合物与DNA、RNA或蛋白质结合，以保护机体免遭毒物损害。
• 分子结构
  • 一级
    • 定义
      • 从N-端至C-端的氨基酸排列顺序，二硫键位置也属于1级结构
    • 主要化学键
      • 肽键
    • 意义
      • 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。
  • 二级
    • 定义
      • 指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，不涉及氨基酸残基侧链的构象
        • 主链骨架原子：N、Cα和C这3个原子依次重复排列
    • 结构基础
      • 肽单元
        • 参与肽键形成的Cα1、C、O、N、H、Cα2位于同一平面，肽单元指此平面6个原子构成的结构
    • 主要化学键
      • 氢键
    • 分类
      • α-螺旋
        • 多肽链主链围绕中心轴有规律的螺旋式上升
        • 螺旋走向为顺时针，右手螺旋
        • 氨基酸侧链在外侧
        • 每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，螺距为0.54nm
        • 每个肽键的N-H和第四个肽键的羰基氧形成氢键，氢键方向与螺旋长轴基本平行
      • β-折叠
        • 锯齿状结构
        • 侧链交替位于锯齿状结构的上下方
        • 正平行、反平行
      • β-转角
        • 通常由4个氨基酸残基组成
        • 第一个残基的羰基氧与第四个残基的氨基氢可形成肽键
      • Ω-环
      • 无规卷曲
    • 影响因素
      • R基太大或太小都不利于α-螺旋形成
      • 没有脯氨酸（亚氨基脱水缩合无法形成氢键，无法形成阿α-螺旋）
      • 带同种电荷的氨基酸不易形成
  • 三级
    • 定义
      • 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置
    • 主要化学键
      • 次级键（疏水键、盐键、氢键和范德华力）
    • 结构模体
      • 定义：蛋白质分子中具有特定空间构象和特定功能的结构成分
      • 意义：模体的特征性空间构象是其具有特殊功能的结构基础
      • 超二级结构：由两个或以上具有二级结构的肽段在空间上相互接近形成的规则二级结构组合。αα、βαβ、ββ
  • 四级
    • 定义
      • 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用
        • 亚基：四级结构中具有完整三级结构的多肽链
    • 主要化学键
      • 氢键和离子键
    • 分类
      • 单体蛋白质：仅由一个亚基组成的并因此无四级结构的蛋白质 （如核糖核酸酶）
      • 寡聚体：由2～10个亚基组成的蛋白质
      • 多聚蛋白质：由10个以上亚基组成的蛋白质
• 分类
  • 组成成分
    • 单纯蛋白质
    • 缀合蛋白质
  • 形状
    • 纤维状蛋白质
    • 球状蛋白质
• 结构与功能的关系
  • 功能
    • 构成细胞和生物体结构
    • 物质运输
    • 催化功能
    • 信息交流
    • 免疫功能
    • 氧化供能
    • 维持机体酸碱平衡
    • 维持正常血浆渗透压
  • 结构与功能关系
    • 一级结构是高级结构与功能基础
      • 一级结构是空间构象的基础
        • 蛋白质一级结构未被破坏，空间构想破坏后可能恢复三级结构
        • 尿素破坏次级键，β-巯基乙醇破坏二硫键，牛核糖核酸酶A破坏磷酸二酯键
      • 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能
      • 通过比较不同种系间的一级结构可以帮助了解物种进化关系
        • 序列相似但非进化相关的2个蛋白质的序列，常被称为相似序列
        • 如细胞色素c
      • 重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病
        • “分子病”：蛋白质分子发生变异所导致的疾病
        • 镰刀型细胞贫血症：血红蛋白β亚基第六位氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸
    • 功能依赖特定空间结构
      • 血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似
        • 肌红蛋白（Mb）
          • 单链蛋白质，含有1个血红素辅基，1分子肌红蛋白结合1分子氧
        • 血红蛋白（Hb）
          • Hb是由4个亚基组成的四级结构
          • 每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧
          • Hb亚基之间通过8对盐键使4个亚基紧密结合形成亲水球状蛋白质
        • 结构相似
          • 血红蛋白的α肽链和β肽链与肌红蛋白的一、二、三级结构类似
          • 肌红蛋白和血红蛋白都含有血红素辅基
      • 血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合
        • 别构效应
          • 受某些因素影响，一级结构不变，空间构象变化导致生物学功能改变
        • 协同效应
          • 一个亚基与其配体结合后能影响此寡聚体中另一个亚基与配体的结合能力。促进为正协同效应，反之为负协同效应
        • “两态”
          • T态：紧张态，不易结合氧
          • R态：松弛态，容易结合氧
      • 蛋白质构象改变可引起疾病
        • 蛋白质构象病：因蛋白质的折叠发生错误，尽管一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变而导致的疾病
        • 例：阿尔茨海默病、疯牛病、亨廷顿病、人纹状体脊髓变性病
        • 疯牛病：朊蛋白是染色体基因编码的蛋白质，不含核酸；朊病毒蛋白中α-螺旋错为β-折叠
        • 有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病
• 理化性质
  • 两性解离
    • 蛋白质等电点
      • 定义：当蛋白质处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电荷为0，此时的溶液pH即为蛋白质等电点
      • 蛋白质等电点大多数接近5.0
    • “酸正碱负”
      • pH高于pI，蛋白质带负电； pH低于pI，蛋白质带正电
  • 胶体
    • 1～100nm
    • 蛋白质胶体稳定因素
      • 水化膜：蛋白质表面为亲水基团
      • 蛋白质胶粒表面带有电荷
    • 特性：电泳、布朗运动、丁达尔现象、不通过半透膜
  • 变性与复性
    • 变性
      • 定义：在某些物理和化学因素作用下蛋白质特定空间构象被破坏，导致理化性质的改变和生物活性的丧失
      • 破坏化学键
        • 二硫键和非共价键，不涉及一级结构的氨基酸序列
      • 变性蛋白质特征
        • 溶解度降低
        • 粘度增加
        • 结晶能力消失
        • 生物活性丧失
        • 易被蛋白酶水解
      • 导致变性的因素
        • 加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属盐、生物碱试剂
      • 应用
        • 消毒灭菌
        • 低温贮存蛋白质制剂（疫苗、抗体）
    • 复性
      • 定义：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质可恢复或部分恢复原有的构象和功能
  • 特征性光吸收
    • 280nm紫外光（色氨酸、酪氨酸）
  • 呈色反应
    • 茚三酮反应
      • 氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物
    • 双缩脲反应
      • 肽键在稀碱中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色
    • Lowry法
      • 在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物，该复合物加入酚试剂后产生蓝色复合物。（蓝色复合物在650nm处的吸光度值与蛋白质的含量成正比）
• 分离纯化
  • 蛋白质沉淀
    • 盐析
      • 不引起蛋白质变性
      • 硫酸铵、硫酸钠或氯化钠
      • 介电子常数变小，解离度降低
      • 分段盐析
        • 定义：不同浓度的同种中性盐使蛋白质分别析出
        • 半饱和硫酸铵析出球蛋白，饱和硫酸铵析出清/白蛋白
    • 有机溶剂
      • 甲醇、乙醇、丙酮
      • 脱水剂
      • 低温乙醇下蛋白质不变性
    • 重金属盐
      • Ag+, Pb2+, Cu2+, As3+
      • pI＜pH
      • 蛋白质变性
    • 生物碱试剂
      • 定义：能沉淀生物碱或是与其发生颜色反应的试剂
      • 多为酸根离子，pI＞pH
      • 蛋白质变性
    • 加热凝固
      • 在等电点附近加热（蛋白质变性且凝固）
      • 远离等电点附近加热蛋白质因带同种电荷而不凝固 （蛋白质变性但不凝固）
    • 免疫沉淀
      • 定义：利用特异性抗体识别相应抗原并形成抗原抗体复合物
  • 透析与超滤法
    • 透析
      • 定义：利用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分开
    • 超滤法
      • 定义：透析的基础上加压
  • 电泳
    • 越远离等电点带电荷越多，走向电极越快
    • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
    • 等点聚焦电泳
      • 定义：在电场中形成一个连续而稳定的线性pH梯度，当蛋白质泳动至与其自身的pI值相等的pH区域时，其净电荷为0不再移动
    • 双向凝胶电泳
  • 层析
    • 离子交换层析
      • 定义：当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。特定离子交换基质结合带相应电荷的蛋白质，蛋白质被留在柱子上，通过提高洗脱液中的盐浓度等措施将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
      • 阴离子交换树脂带正电，结合阴离子； 阳离子交换树脂带负电，结合阳离子。
    • 凝胶过滤层析
      • 定义：当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短。
      • 填充物多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质
  • 超速离心
    • 分子量小在上，分子量大在下
    • 蛋白质在离心力场中的沉降行为用沉降系数S表示