基因工程

高中生物选修三基因工程知识点梳理，课后可直接拿下图进行复习。

基因工程

• 概念
  • 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
• 基本工具
  • “分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
    • 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的（约4000种）
    • 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列（一般为6个核苷酸对组成的序列，少数是4个或5个，序列均为回文序列），并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
    • 结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端
  • ”分子缝合针“——DNA连接酶
    • 两种DNA连接酶(E-coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较:
      • 相同点:都缝合磷酸二酯键
      • 区别: EcoliDNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性 末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平 末端的之间的效率较低
  • “分子运输车”——载体
    • 载体具备的条件
      • 能在受体细胞中复制并稳定保存
      • 具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入
      • 具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择
    • 最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。（在基因操作中，真正被用做载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行了人工改造）
    • 其他载体
      • l-噬菌体的衍生物、动植物病毒
• 基本操作程序
  • 第一步：目的基因的获取
    • 1.从基因文库中获取目的基因
      • 基因文库的含义
        • 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
      • 基因文库的种类
        • 基因组文库：含有一种生物的所有基因
        • 部分基因文库：含有一种生物的部分基因
      • 目的基因的获取依据
        • 基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等。
    • 2.PCR技术扩增目的基因（目的基因的部分序列已知）
      • 原理：DNA双链复制
      • 条件：模板DNA、两种引物、四种脱氧核苷酸、Tap酶
      • 过程
        • 变性：加热至90~95℃，DNA解链；
        • 复性/退火：冷却到55~60℃，引物结合到互补DNA链
        • 延伸：加热至70~75℃，热稳定DNA聚合酶从引物的3'端开始互补链的合成。
    • 3.反转录法获取cDNA
      • 提取相应基因表达细胞中的mDNA,在逆转录酶的作用下反转录合成互补DNA（cDNA），此DNA不含启动子、终止子、内含子
    • 4.化学方法人工合成目的基因
      • 基因较小，序列已知
  • 第二步：基因表达载体的构建（核心）
    • 1.目的
      • 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用
    • 2.组成
      • 启动子+目的基因+终止子+标记基因
      • （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的手段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA
      • （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，终止转录
      • （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因
  • 第三步：将目的基因导入受体细胞
    • 1.转化的概念
      • 是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
    • 2.常用的转化方法
      • 将目的基因导入植物细胞
        • 采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
      • 将目的基因导入动物细胞
        • 最常用的方法是显微注射技术。受体细胞多是受精卵，也可以是核移植的重组细胞。
      • 将目的基因导入微生物细胞
        • 原核生物作为受体细胞的原因是_繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少， 其转化方法是: Ca2+处理细胞→感受态细胞→表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
    • 3.重组DNA导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达
  • 第四步：目的基因的检测和表达
    • 1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术
    • 2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交
    • 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交
    • 4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如：转基因抗虫植物是否出现抗虫性状
• 应用
  • 1.植物基因工程
    • 抗虫、抗病。抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质
  • 2.动物基因工程
    • 提高动物生长速度、改良畜产品品质、用转基因动物生产药物（乳腺生物反应器）
  • 3.基因治疗
    • 把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用
• 蛋白质工程
  • 1.概念
    • 通过基因改造，对现有基因进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程是生产自然界中不存在的蛋白质）
  • 2.过程
    • 预期蛋白质功能®设计预期的蛋白质结构®推测应有的氨基酸序列®找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）