基因工程中动物基因工程部分

包括动物基因工程分类，载体种类，基因转移技术，基因表达水平的检测，以及哺乳动物中重点的介绍。

动物基因工程

• 基因转移技术
  • 物理转染
    • 电击法（外加电场使细胞膜电位发生改变，瞬间出现可逆性电穿孔）
    • 超声波法（超声波的空化效应导致细胞通透性提高）
    • 显微注射法（玻璃微管直接注DNA至哺乳动物受精卵原核内）
    • 基因枪法（DNA吸附到高粘度金属颗粒上被打入细胞）
  • 化学转染
    • 磷酸钙共沉淀法
      • DNA溶解在磷酸缓冲液中，加CaCl2，DNA被包裹在磷酸钙颗粒中，经吞噬泡进入细胞
    • 脂质体介导法
      • DNA与磷脂混合，后者在表面活性剂存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构
    • 原生质体融合
      • 含目的基因的质粒转化细菌或酵母菌，扩增后除壁成原生质体，铺在哺乳动物细胞上，PEG等融合
  • 病毒感染法
• 哺乳动物
  • 工程分类
    • 高等哺乳动物转基因技术
      • 转基因动物个体
        • 性状改良；药物筛选研究评价模型；人体基因治疗
    • 高等哺乳动物细胞基因表达技术
      • 动物工程细胞
        • 蛋白多肽物质大规模生产；药物筛选研究评价模型
  • 受体系统
    • 正常哺乳动物细胞特征
      • 锚地依赖性（附着固体/固定表面才能生长分裂）
      • 血清依赖性（必需有生长因子才能生长）
      • 接触抑制性
      • 形态依赖性（扁平，有长纤维网状结构）
    • 受体条件
      • 细胞系特征
        • 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性，便于大规模培养）
      • 遗传稳定性
        • 多次传代不丢失，长期保存
      • 合适的标记
        • 便于转化株的筛选和维持
      • 生长快且齐
        • 分裂周期短，生长均一，便于控制
      • 安全性能好
        • 不合成分泌致病物质，不致癌
      • 大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺
    • 常用CHO（中国仓鼠卵巢细胞）
  • 典型遗传标记
    • 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，
    • 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长
    • 在载体上加相应互补基因tk/hprt
• 传代与检测
  • 一般转基因检测阳性×非转基因，判断是否能稳定遗传
• 表达水平检测
  • DNA水平
    • 报告基因
      • 表达产物易检测
  • RNA水平
    • Northern杂交
      • 检测是否转录出目的基因的mRNA
    • 反转录PCR
      • 根据mRNA反转录产生cDNA作为第一链扩增，通过是否有目的基因条带判断目的基因是否表达
  • 蛋白质水平
    • 聚丙烯酰胺凝胶电泳（蛋白质）
    • western杂交
    • 目的蛋白生物活性
• 载体
  • 质粒型表达载体
    • 原核复制区和选择性标记基因，保证重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增
    • 转录外源DNA序列的启动元件、转录产物有效地加上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核细胞中的选择性标记，使在真核表达
    • 附加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受点，以保证外源基因的高效表达
  • 病毒载体
    • 条件：携带外源基因并能够包装成病毒颗粒，介导外源基因的转移与表达，对机体不致病
    • 腺病毒：安全性好，不会整合到人染色体；宿主范围广，且对受体细胞是否处于分裂期要求不高；易高效表达
    • 猴多瘤病毒SV40只能转染猴细胞
    • 腺相关病毒AAV，反转录病毒
  • 定向打靶载体
    • 基因打靶技术
      • 通过外源基因与靶细胞染色体上的同源序列间的同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞特定位置上
• 分类
  • 遗传性动物基因工程
    • 外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定的遗传
  • 非遗传性动物基因工程
    • 转基因仅在当代表现，不能够遗传给子代