第十二章：DNA的合成

根据人卫第9版生物化学与分子生物学的第十二章：DNA合成相关知识总结，分享给各位学医的同学参考，可作为期末复习资料使用。

第十二章 DNA的合成

• 第一节 DNA复制的基本规律
  • DNA复制的主要特征:
    • 半保留复制(semi-conservative replication)
      • 定义：
      • 在复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链
      • 半保留复制的意义:
      • 依据半保留复制的方式，子代DNA中保留了亲代的全部遗传信息，亲代与子代DNA之间碱基序列的高度一致遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的
    • 双向复制(bidirectional replication)
      • 原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制
      • 真核生物每个染色体又有多个起点，呈多起点双向复制特征。每个起点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域称为复制子（replicon）。复制子是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位
    • 半不连续复制(semi-discontinuous replication)
      • 沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的，这股链称为前导链（leading strand）
      • 另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能随着模板链的解开，逐段地从5′→3′生成引物并复制子链。模板被打开一段，起始合成一段子链；再打开一段，再起始合成另一段子链，这一不连续复制的链称为后随链（lagging strand）
      • 沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段（Okazaki fragment）
    • DNA复制具有高保真性
      • “半保留复制”确保亲代和子代DNA分子之间信息传递的绝对保真性
      • 高保真度DNA聚合酶利用严格的碱基配对原则是保证复制保真性的机制之一；体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性；DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校读功能以及复制后修复系统对错配加以纠正
• 第二节 DNA复制的酶学和拓扑学
  • 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP
    • 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol
    • 模板(template): 解开成单链的DNA母链
    • 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合
    • 其他的酶和蛋白质因子
    • 参与DNA复制的物质:
  • DNA聚合酶催化脱 氧核苷酸间的聚合
    • 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)
    • 简称：DNA-pol
    • 活性：
      • 1. 5’3’的聚合活性
      • 2. 核酸外切酶活性
        • 3’5’外切酶活性:
          • 能辨认错配的碱基对，并将其水解
        • 5’3’外切酶活性:
          • 能切除突变的 DNA片段
    • （一）原核生物有3种DNA聚合酶
      • 常见的有5种
      • DNA-pol Ⅰ
        • 对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补
      • DNA-pol Ⅱ
        • DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活
        • DNA-pol Ⅱ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复
      • DNA-pol Ⅲ
    • DNA聚合酶Ⅲ全酶结构:
      • ２个核心酶
      • 1个γ复合物
        • 6种亚基组成：、、、、、
        • 功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用
      • 1对β亚基
      • 两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用
  • DNA聚合酶的碱基选择和校对功能
    • DNA复制的保真性至少要依赖三种机制:
    • 复制的保真性依赖正确的碱基选择
      • 利用“错配”实验发现，DNA pol Ⅲ对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能
      • DNA pol Ⅲ对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实现其选择功能
    • 聚合酶中的核酸外切酶活性在 复制中辨认切除错配碱基并加以校正
      • 核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的
    • 复制中DNA 分子拓扑学变化
      • DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。
      • 多种酶参与DNA解链和稳定单链状态
        • 标注
          • 解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链
          • 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA引物的酶
          • 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整
          • 拓扑异构酶分类及作用机制：
          • 拓扑异构酶Ⅰ：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当 时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP
          • 拓扑异构酶Ⅱ：切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态
          • 既能水解 、又能连接磷酸二酯键
        • 拓扑异构酶作用特点:
    • DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口
      • DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：
        • 功能
          • DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用
          • 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用
          • 也是基因工程的重要工具酶之一
      • 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链
• 第三节 原核生物DNA复制过程
  • 复制的起始
    • 起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物
    • 1. DNA解开成单链，提供模板
    • 2. 形成引发体，合成引物，提供3-OH末端
    • 引物合成和起始复合物形成
      • 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为起始复合物
      • 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子
  • DNA链的延长
    • 复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成
    • 领头链的子链沿着5→3方向可以连续地延长
  • 复制的终止
    • 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合
• 第四节 真核生物DNA复制过程
  • 真核生物与原核生物DNA复制的差异：
    • 真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等
    • DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶转换
    • 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等
    • 哺乳动物的细胞周期
      • DNA合成期
        • 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这 两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与 蛋白激酶活性有关
        • 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种 复制因子而实施调控作用
  • 真核生物复制的起始与原核基本相似
    • 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动
    • 复制的起始需要DNA-pol α（引物酶活性）、pol δ和pol ε参与。还需解螺旋酶活性、拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)
    • 酵母复制起始点
      • 酵母染色体含有多个复制起点。
      • 酵母复制起点为自主复制序列 （autonomously replicating sequences，ARS）：
      • 元件A(富含A/T的共有序列)：结合一个特异的蛋白质复合物──复制起点识别复合物(ORC)
      • 3个序列(B1、B2和B3)可以增加复制起点的效率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同
  • 真核生物复制的延长发生DNA聚合酶转换
    • 现在认为pol α主要催化合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol δ和DNA pol ε所替换，这一过程称为聚合酶转换。DNA pol δ负责合成后随链，DNA pol ε负责合成前导链。
    • 前导链：出现在引发后期
    • 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际
    • 发生DNA聚合酶转换的原因是Pol 不具备持续合成能力
    • DNA聚合酶转换的关键蛋白是RFC
  • 真核生物DNA合成后立即组装成核小体
  • 端粒酶参与解决染色体末端复制问题
    • 染色体DNA呈线状，复制在末端停止
    • 复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接
    • 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙
    • 端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成
    • 人的端粒重复序列为5’-(TnGn)x-3
    • 这些重复序列多为双链，但每个染色体的3’端比5端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题
    • 端粒酶(telomerase)
      • 组成：
      • 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)
      • 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)
      • 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)
      • 端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成
      • 端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3’端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体的3端。这些新合成的DNA为单链
  • 真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次
    • 真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次
    • 前复制复合物在G1期形成而在S期被激活
    • 复制基因（replicator）是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列
    • 真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活
  • CDK控制pre-RC的形成和激活
    • 真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严格控制pre-RC的形成和激活
  • Cdk功能：
    • 激活pre-RC，以起始DNA复制
    • 抑制形成新的pre-RC
  • 真核生物线粒体DNA按D环方式复制
    • D-环复制（D-loop replication）是线粒体DNA的复制形式
• 第五节 逆转录
  • 逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制
    • 逆转录(reverse transcription)
    • 逆转录酶(reverse transcriptase)
    • RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因
    • cDNA complementary DNA
      • 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链
      • 分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法
  • 逆转录的发现发展了中心法则
    • 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现
    • 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能
    • 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论