考研生化 基因重组

临床医学考研--生化--基因重组，如工具酶：①限制性核酸内切酶II型（限制酶 / RE）（多来自细菌）、②DNA连接酶、③碱性磷酸酶、④逆转录酶、⑤DNA pol I（Klenow片段）、⑥多聚核苷酸激酶、⑦末端转移酶。

基因重组

• 步骤
  • 得到目的基因
    • 化学合成法
    • 基因组文库法
    • cDNA文库法（逆转录法）
    • PCR法（最常用）
    • 酵母杂交系统
  • • • 选择载体
        • 克隆载体
          • 质粒（细菌染色体外的小分子双链环状DNA）、噬菌体DNA、细菌 / 酵母人工染色体、柯斯 / 黏粒载体
          • *至少有一个复制起点—使载体在宿主细胞自主复制—外源DNA同步扩增（最基本）
          • *至少有一个选择标志—区分含 / 不含载体的细胞
          • *有适宜RE单一切点—供外源基因插入
        • 表达载体
          • 原核（大肠杆菌）、真核
      • step1：目的基因 + 载体 = 重组DNA
        • 黏性末端连接（同一RE酶切位点的连接）
        • 平端连接
        • 黏-平末端连接
      • step2：重组DNA转入受体细胞扩增 / 表达
        • 转化：外源DNA直接导入细菌 / 真菌
        • 转染：外源DNA直接导入真核细胞（除外酵母）/ 噬菌体DNA直接导入受体细菌
        • 感染：以噬菌体 / 逆转录病毒 / 腺病毒DNA作载体构建的重组DNA经包装→病毒颗粒 → 导入宿主细胞
      • step2：筛选扩增 / 表达的产物
        • 借助载体遗传标志
          • 抗生素耐药性、基因插入失活 / 表达、标志补救（a-互补）、噬菌体包装
            • 记忆：速查不均
        • 借助序列特异性
          • DNA测序（最准确）、PCR、RE酶切、核酸杂交
        • 借助亲和筛选
          • 抗原-抗体、配体-受体
• 工具酶
  • 构建重组DNA
    • ①限制性核酸内切酶II型（限制酶 / RE）（多来自细菌）
      • 识别并切割DNA双链内部的特异位点（回文结构 / 反向重复序列）、产生黏性末端
      • *RE对甲基化的自身DNA不起作用
    • ②DNA连接酶
      • 连接目的基因 + 载体
    • ③碱性磷酸酶
      • 切除末端磷酸基团（防止载体末端磷酸和-OH自连）
  • ④逆转录酶
    • 合成cDNA第一链
  • ⑤DNApol I的Klenow片段
    • 合成cDNA第二链、标记双链DNA 3‘端、制作探针
  • ⑥多聚核苷酸激酶
    • 5-OH末端磷酸化、制作探针
  • ⑦末端转移酶
    • 3-OH末端加尾
  • eg. 从mRNA 构建DNA重组体
    • 质粒（载体）
    • 逆转录酶：合成第一链
    • DNApol I：合成cDNA第二链：标记3‘端、制作探针
    • RE：识别特异的回文结构 / 反向重复序列，切割DNA双链
    • 碱性磷酸酶
    • DNA连接酶