第二十三章DNA重组和重组DNA技术

人卫第九版生物化学与分子生物学第二十三章DNA重组和重组DNA技术的思维导图，本人已调整修改，可以直接导出成pdf，调节页码，打印出来。如有疑问，可以点击主页添加联系方式。

DNA重组和重组DNA技术

• 基本概念：
  • DNA重组（DNA recombination）
    • 是指不同DNA分子经过断裂和连接形成新DNA分子的过程
  • 重组DNA技术（Technology of DNA recombination）
    • 是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程
• 第一节 自然界的DN A重组和基因转移
  • 一、同源重组是最基 本的DNA重组方式
    • 同源重组（homologous recombination）
      • ——又称基本重组（general recombination）
      • ——是指发生在两个DNA分子同源序列之间的互换过程
    • （一）Holliday模型是最 经典的同源重组模式
      • 四个关键步骤：
        • 1.两个同源染色体DNA排列整齐
        • 2.一个DNA的一条链断裂，并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体（inter-mediate）
        • 3.通过分支移动（branch migration）产生异源双链（heteroduplex）DNA
        • 4.Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA
    • （二）RecBCD模式是大 肠埃希菌的Holliday同源重组
      • RecBCD复合物
        • 三种酶活性：
          • ——核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶活性
      • RecA蛋白
        • 可结合单链DNA（ssDNA）
      • RuvC蛋白
        • 核酸内切酶活性
        • 能专一性识别Holliday连接点
  • 二、位点特异性重组是发生在特异位点间的DNA整合
    • 位点特异性重组：
      • 由整合酶催化完成
  • 三、转座重组可使基因位移
    • 转座重组：
      • 是指基因（或DNA序列）从一个位置移动到另一位置
    • 这些可移动的DNA序列包括：
      • 插入序列（insertion sequence, IS）
      • 转座子（transposon, Tn）
    • （一）插入序列是最简单的转座元件
      • 结构特征：
        • 两端是反向重复序列
        • 中间是一个转座酶
        • 编码基因
    • （二）转座子可以在染色体间转座
      • 转座子（transposon, Tn）
        • 与IS类似点：侧翼是反向重复序列，并有转座酶基因
        • 与IS不同点：含有抗生素抗性等基因
      • 在很多Tn中，其侧翼序列本身就是IS
  • 四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组
    • 接合作用（conjugation）：
      • 是质粒DNA通过细胞间相互接触发生转移的现象
    • 转化作用（transformation）：
      • 是受体细胞自主摄取外源DNA并与之整合的现象
    • 转导作用（transduction）：
      • 是病毒将供体DNA带入受体并与之染色体发生整合的现象
  • 五、细菌可通过CRISPR/Cas系统从病 毒获得DNA片段作为获得性免疫机制
    • 1．CRISPR序列的结构特征
    • 2. 外源DNA可插入宿主基 因组的CRISPR座位中
      • 当噬菌体感 染宿主菌时
        • 靶向性复合物与病毒DNA片段形成Cas1Cas2复合物
        • Cas1Cas2复合物将病毒DNA片段插入宿主菌基因组DNA的CRISPR座位的第一个位点
        • 插入的DNA片段两端是重复序列
    • 3. CRISPR/Cas系统是 细菌的获得性免疫机制
      • 当噬菌体再次 感染宿主菌时
        • CRISPR座位转录产生pre-crRNA
        • tracrRNA基因转录产生tracrRNA
        • tracrRNA与pre-crRNA在cas9作用下形成引导RNA（gRNA）-cas9复合物
        • gRNA-Cas9复合物靶向病毒DNA并将其切割消化
• 第二节 重组 DNA技术
  • 又称：
    • 分子克隆（molecular cloning）
    • DNA克隆（DNA cloning）
    • 基因工程（genetic engineering）
  • 主要过程：
    • 在体外将目的DNA与能自主复制的遗传元件（载体）连接，形成重组DNA分子
    • 重组DNA分子在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得单一DNA分子的大量拷贝
  • 一、重组DNA技术中常用的工具酶
    • 限制性核酸内切酶（RE）
      • I型、II型、III型
      • I型和III型酶为复合功能酶，同时具有限制和DNA修饰两种作用，且不在所识别的位点切割DNA（即特异性不强）
      • II型酶能在DNA双链内部的特异位点识别并切割，故其被广泛用作“分子剪刀”，对DNA进行精确切割
      • II型
        • 识别位点通常为6或4个碱基序列，个别的RE识别8或8个以上碱基序列
        • 大多数RE的识别序列为回文结构（palindrome）
        • 有些RE所识别的序列虽然不完全相同，但切割DNA双链后可产生相同的黏端，这样的酶彼此互称同尾酶（isocaudamer）
        • 有些RE虽然来源不同，但能识别同一序列（切割位点可相同或不同），这样的两种酶成同裂酶（isoschizomer）
    • DNA连接酶
    • DNA聚合酶
    • 逆转录酶
    • 碱性磷酸酶
    • 其中RE和DNA连接酶是最常用的工具酶
  • 二、重组DNA技 术中常用的载体
    • 载体（vector）
      • 是为携带目的外源DNA片段、实现外源DNA在受体细胞中无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些DNA分子
      • 按其功能可分为两类：
        • 克隆载体（cloning vector）
        • 表达载体（expression vector）
    • （一）克隆载体用于扩增克隆化DNA分子
      • 克隆载体
        • 是指用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子。
        • 特点：
          • 1.至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增；
          • 2.至少有一个选择标志（selection marker），从而区分含有载体和不含有载体的细胞，如抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等；
          • 3.有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体。
      • 质粒克隆载体
        • 是重组DNA技术中最常用的载体
      • 质粒：
        • 是细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的双链环状DNA分子，具备作为克隆载体的基本特点
    • （二）表达载体能为外源 基因提供表达元件
      • 表达载体
        • 是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体
        • 依据其宿主细 胞的不同可分为：
          • 原核表达载体（prokaryotic expression vector）
            • 用于在原核细胞中表达外源基因
            • 除了具有克隆载体的基本特征外，还有供 外源基因有效转录和翻译的原核表达调控序列，如 启动子、核糖体结合位点即SD序列（Shine-Dalg arno sequence）、转录终止序列等
          • 真核表达载体（eukaryotic expression vector）
            • 除了具备克隆载体的基本特征外，所提供 给外源基因的表达元件是来自真核细胞的。
          • 二者的区别主要在于为外源基因提供的表达元件。
        • 质粒真核表达载体的特点：
          • 1.含有必不可少的原核序列，如复制起点、抗性基因、MCS等
          • 2.真核表达调控元件，如真核启动子、增强子、转录终止序列、poly A加尾信号等
          • 3.真核细胞复制起始序列
          • 4.真核细胞药物抗性基因
  • 三、重组DNA技术的 基本原理和操作步骤
    • 一个完整的DNA克隆过程五大步骤：
      • 1.目的DNA的分离获取（分）
      • 2.载体的选择与准备（选）
      • 3.目的DNA与载体的连接（连）
      • 4.重组DNA转入受体细胞（转）
      • 5.重组体的筛选及鉴定（筛）
    • （一）目的DNA的分离获取是DNA克隆的第一步
      • 化学合成法
      • 从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA
      • PCR法
      • 其他，如酵母双杂交系统克隆DNA结合蛋白基因
      • 目前最常用的方法是PCR法
    • （二）载体的选择与准备是根据目的DNA片段决定的
      • DNA克隆的目的主要有二
        • 一是获取目的DNA片段
          • 通常选用克隆载体
        • 二是获取目的DNA片段所编码的蛋白质
          • 需选择表达载体
    • （三）目的DNA与载体连接形成重组DNA
      • 依据目的DNA和线性化载体末端的特点连接策略如下：
        • 黏端连接：
          • 单酶相同黏端的连接
          • 不同黏端的连接
          • 通过加尾产生黏端的连接
        • 平端连接
        • 黏-平端连接
        • 黏端、黏-平端连接，具有方向性
        • 平端连接，没有方向性
    • （四）重组DNA转入受体 细胞使其在体内得以扩增
      • 将重组DNA导入宿主 细胞常用方法有如下：
        • 转化：
          • 是指将外源DNA直接导入细菌、真菌的过程，受体细胞经过处理成为感受态细胞
        • 转染：
          • 是指将外源DNA直接导入真核细胞（酵母除外）的过程，常用磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法
        • 感染：
          • 是指以病毒颗粒作为外源DNA运载体导入宿主细胞的过程，如噬菌体、腺病毒等
    • （五）重组体的筛选与鉴定
      • 重组DNA分子导入宿主细胞后，可通过载体携带的选择标记或目的DNA片段的序列特征进行筛选和鉴定，从而获得含重组DNA分子的宿主细胞
      • 筛选和鉴定方法主要有：
        • 1. 遗传标志筛选法
          • 抗生素抗性筛选
          • 插入失活/插入表达筛选
          • 利用标志补救筛选
          • 利用噬菌体的包装特性筛选
        • 2. 序列特异性筛选，如核酸杂交法，DNA测序法
        • 3. 亲和筛选法
    • （六）克隆基因的表达
      • 表达体系可笼 统地分为：
        • 原核表达体系
          • 条件
            • 含大肠杆菌适宜的选择标志
            • 具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子
            • 含适当的翻译控制序列
            • 含有合理设计的MCS
          • 缺点
            • 缺乏转录后加工机制
            • 缺乏适当的翻译后加工机制
            • 外源基因表达的蛋白质易形成不溶性包含体
            • 很难用E.coli表达体系表达大量的可溶性蛋白质
          • 因此，对于很多真核基因的表达需要采用真核表达体系
        • 真核表达体系
          • 真核表达载体通常含有供真核细胞用的选择标记、启动子、转录和翻译终止信号、mRNA的poly A加尾信号或染色体整合位点等。
          • 优势：
            • 具有转录后加工机制
            • 具有翻译后修饰机制
            • 表达的蛋白质一般不形成包含体
            • 表达的蛋白一般不易被降解
• 第三节 重组DNA技术在医学中的应用
  • 一、重组DNA技术用于生物制药
    • 重组人胰岛素、干扰素等
    • 重组HBV、HPV VLP疫苗
    • 人源化单克隆抗体，如赫赛汀
  • 二、重组DNA技术是医学研究的重要技术平台
    • 人类疾病动物模型
    • 遗传修饰细胞模型
    • 发现基因新功能或新基因
  • 三、重组DNA技术是基因及其表达产物研究的技术基础
    • 1. 在基因组水平上干预基因
    • 2.在RNA水平上干预基因的功能
    • 3. 研究蛋白质的相互作用