Cre-LoxP系统

这是一篇关于Cre-LoxP系统的思维导图，主要内容包括：更精准的诱导型Cre-loxP系统，条件性基因敲除，条件性基因表达，应用，DNA重组结果主要取决于loxP位点的方向及位置，LoxP位点，cre重组酶。

Cre-LoxP系统

• cre重组酶
  • 来源：大肠杆菌P1噬菌体，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质
  • 目的：特异性识别loxP位点，从而重组LoxP位点间的DNA片段
  • 相同作用：Flp（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）
• LoxP位点
  • 长34bp（34个碱基的一段DNA序列）
  • 特点
    • 回文结构为Cre重组酶的识别序列；核心结构为重组发生序列，也决定了lox位点的方向。
    • loxP有多种突变类型，多种突变类型之间不交叉识别。N表示可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的loxP位点，除了wild-type loxP，常见的还有lox 2272，lox 511，lox 5171等。
• DNA重组结果主要取决于loxP位点的方向及位置
  • Deletion（删除）：两个loxP位点位于同一染色体上且方向相同，Cre重组酶删除loxP位点间的DNA序列；
  • Inversion（倒转）：两个loxP位点位于同一染色体上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP位点间的DNA序列倒转；
  • Translocation（易位）：两个loxP位点位于不同染色体上且方向相同，Cre重组酶诱导DNA序列交换
• 应用
  • 利用Cre-loxP系统在小鼠体内实现对基因的时空特异性打靶（表达或敲除），原则上需要建立两种小鼠。
  • 首先，建立Cre小鼠。该小鼠中的Cre重组酶由特定启动子驱动，可在特定细胞或组织或全身表达Cre重组酶。Cre重组酶的特异性由驱动Cre的启动子（Promoter）或增强子（Enhancer）控制。
  • 其次，建立Flox（flanking/flanked by loxP）小鼠。该小鼠靶基因序列侧翼带有loxP位点。
  • 将上述两种小鼠杂交繁育，子代中可以获得既带有Cre又带有Flox基因的小鼠，即条件性基因打靶（表达或敲除靶基因）小鼠
• 条件性基因表达
  • 条件性基因表达所需要的Flox小鼠，一般在目的基因与启动子之间有一个“终止盒”（loxP-stop-loxP），来阻止目的基因的转录。这种Flox小鼠与Cre小鼠交配获得的子代小鼠，终止盒被Cre重组酶切除，细胞或组织特异性表达目的基因。
• 条件性基因敲除
  • 条件性基因敲除所需要的Flox小鼠，一般在需要敲除的目的基因两侧带有同方向的两个loxP位点（loxP-GENE-loxP）。这种Flox小鼠与Cre小鼠交配获得的子代小鼠，特异性细胞或组织中的目的基因被Cre重组酶敲除
• 更精准的诱导型Cre-loxP系统
  • 将Cre与雌激素受体（ER）的配体结合区（LBD）融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白（Cre-ER）。在没有Tam的情况下，Cre-ER与热休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于细胞质中（图4.1）。给予Tam处理后，Tam在体内被代谢为4-羟基他莫昔芬（4-OHT），4-OHT与Cre-ER相互作用，使Cre-ER从锚定蛋白HSP90上解离下来（图4.2），进入细胞核（图4.3）。在细胞核中，Cre-ER识别loxP位点（图4.4）并使组织X中的基因Y敲除（图4.5）。
  • Cre-ERT2在体内对药物诱导的敏感性更高，因此一般优选使用Cre-ERT2
  • 为了避免内源雌激素的干扰，在LBD做一个点突变（G521R）就可以使Cre-ER只响应外源的人工合成雌激素（比如：Tam、4-OHT）的诱导，命名为 Cre-ERT。而另一种LBD突变体融合蛋白（Cre-ERT2）被证明对4-OHT具有远高于Cre-ERT的敏感性，它带有LBD中的3个点突变：C400V/M453A/L544A。
  • 如何测试一个新的Cre小鼠品系
    • 利用Reporter小鼠与Cre小鼠杂交来验证Cre的表达
    • Reporter小鼠，就是敲入了报告基因（reporter gene）的小鼠。常见的有TdTomato鼠、mT/mG鼠、LacZ鼠、彩虹鼠等，用于验证Cre小鼠的特异性表达
    • tdTomato小鼠在ROSA位点敲入了CAG启动子、tdTomato蛋白编码序列和WPRE序列，并在CAG启动子和tdTomato序列之间插入了loxP-3×stop-loxP（LSL）序列（ROSA26-CAG-LSL-tdTomato-WPRE-pA）。 tdTomato小鼠在正常情况下由于3×stop的存在并不能表达红色荧光。当与Cre小鼠或Tam激活的Cre-ERT2小鼠交配后，产生的后代由于Cre重组酶将loxP位点间的3×stop序列切除，tdTomato得到表达，就可以在Cre或Cre-ERT2表达的细胞或组织中发出红色荧光，指示基因的位置。