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生物技术制药
生物技术制药，包括基因工程制药，动物细胞工程制药，抗体制药，植物细胞工程制药，酶工程制药，发酵工程制药。
编辑于2021-11-02 10:57:56- 生物制药
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- 大纲
生物技术制药
基因工程制药
概述
基因工程
定义：利用DNA重组技术在体外通过人工剪切和拼接等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞表达，产生人类需要的基因产物，达到定向改造生物遗传特性或者创造新物种的目的
三大要素
供体，受体，载体
三大技术
剪切，连接，转入
基因工程生产药物的优点
大量生产过去难以获得生理活性的蛋白
提供足够数量的活性物质，便于研究
发现，挖掘更多内源性生物活性物质
去除和改造内源生理活性物质作为药物的不足之处
获得新型化合物，扩大药物筛选来源
生产药物
免疫蛋白
细胞因子
激素
酶类
基因工程药物生产的基本过程
上游阶段
目的基因的克隆
构建重组体DNA
将重组体DNA 转入宿主菌构建工程菌
下游阶段
工程菌发酵
产物分离纯化
产品检验
包装
目的基因的获得
逆转录法：逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。
mRNA 的纯化
cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA克隆
CDNA片段与载体的连接
将重组体导入宿主细胞
cDNA文库的鉴定
目的cDNA克隆的分离和鉴定
化学合成法
前提条件:必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再.按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。
限制
不能合成太长的基因。
人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难。得到的结果可能与天然基因不完全一致。
费用高
基因表达
主要问题
目的基因的表达产量
表达产物的稳定性
产物的生物学活性和表达产物的分离纯化
宿主细胞的选择
宿主细胞应满足得要求
容易获得较高浓度的细胞
能利用廉价易得的原料
不致病、不产生内毒素
发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态
容易进行代谢调控
容易进行DNA重组技术操作
7产物的产量、产率高，产物容易提取
宿主可类
原核细胞
大肠杆菌
特点
生长迅速
表达基因工程产物的形式多种多样
有细胞内不溶性表达(包含体)、胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数还可以分泌到细胞外表达。
缺陷
表达产物多为胞内产物，需破碎细胞才能得到产物
表达产物常无活性
产物容易在细胞内被蛋白酶所破坏
枯草芽孢杆菌
优点
分泌能力强可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。
缺点
该菌也不能使蛋白质产物糖基化另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解。
链霉菌
主要特点:不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。
真核细胞
酵母菌
是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，基因组小，仅为大肠杆菌的4倍，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。
繁殖迅速、可以廉价地大规模培养，且没有毒性。
能将表达产物直接分泌到胞外，表达产物能糖基化。
丝状真菌
有很强的蛋白质分泌能力;
能正确进行翻译后加工;
糖基化方式与高等真核生物相似;
是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺。
哺乳动物细胞
优点
产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易，表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物;
缺点
动物细胞生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。
大肠杆菌中的基因表达
表达载体
载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型，严紧型伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少，松弛型的复制可不依赖于宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达3000个。
应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。
应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。
应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。
所产生的 mRNA必须有翻译的起始信号(AUG)
目的基因在大肠杆菌中表达的影响因素
外源基因的拷贝数
外源基因的表达效率
表达产物的稳定性
细胞的代谢负荷
工程菌的培养条件
真核基因在大肠杆菌中的表达形式
融合蛋白，非融合蛋自，分泌型
酵母中的基因表达
表达载体
普通表达载体和精确表达载体
目的基因在酵母菌中表达的影响因素
外源基因的拷贝数
外源基因的表达效率
外源蛋白的糖基化
宿主菌株的影响
基因工程菌的稳定性
分类
质粒结构不稳定
有分裂不稳定
提高质粒稳定的方法
采用两阶段法，第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。
在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。
适当的操作方式也可使工程菌生长速率具有优势，调控温度、pH、培养基组分、溶解氧，通过间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。
基因工程菌的生长代谢特点
菌体生长与能量的关系
菌体生长与前提供应的关系
基因工程菌发酵
基因工程菌的培养方式
补料分批培养
连续培养
透析培养
固定化培养
基因工程菌的发酵工艺
培养基的影响
接种量的影响
温度的影响
溶解氧的影响
诱导时机的影响
pH的影响
基因工程药物的质量监控
原料质量控制
培养过程治疗控制
纯化工艺过程的质量控制
目标产品的质量控制
产品鉴别，纯度分析，生物活性测定，稳定性考察，产品一致性保证，产品保存
动物细胞工程制药
概述
发现细胞和细胞学说创立。
组织培养或细胞培养
细胞工程学时代
细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。
动物细胞的形态和生理特点
动物细胞的形态
贴壁细胞，悬浮细胞，兼性贴壁细胞
动物细胞的生理特点
细胞分裂周期长
细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象
正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
动物细胞对周围环境比较敏感
动物细胞培养基的要求高
动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不同
动物生产制药的优缺点
缺点:培养条件高、成本贵、产量低。
优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。
生产用动物细胞的要求和获得
生产用动物细胞的要求
原代正常组织分离的细胞
二倍体细胞，即使是传代细胞
传代细胞用于生产
按照FDA对细胞株的要求，控制最终产品中DNA残留量。
生产动物细胞的获得
原代细胞
是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。
二倍体细胞系
原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。
转化细胞系
失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。
融合细胞系
动物细胞融合技术----也称动物体细胞杂交技术，是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下，合并为一个多核细胞的过程。
病毒诱导融合
PEG 诱导融合
电场诱导融合
其它诱导融合
常用生产用动物细胞的特性
WI-38
1961年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系，核型2n=46。该细胞是成纤维细胞，能产生胶原
MRC-5
1966年来源于14周正常男性，对多种人的病毒敏感，用于疫苗的生产。
CHO-K1
1957年从中国地鼠卵巢中分离的一株上皮样细胞。 目前广泛用于构建工程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株CHO-dhfr。
BHK-21
1961年从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，现在已被用于构建工程细胞。
Vero
1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率为1.7%，可持续地进行培养。
Namalwa
1972年来源于肯尼亚患有 Burkitt淋巴瘤的病人体中， 多数细胞有12~14条标记染色体，单条 X染色体，无Y染色体。
SP2/0-Ag14
该细胞是1978年中通过融合的方法，从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Aq8融合的杂交瘤SP2/HL-Ag亚克隆中分离得到。它不分泌任何免疫球蛋白抗体链，能耐受8-氮鸟 呤 但在含HAT选择培养基中不能存活。
Sf-9
1983年从亲代IPLB-SF21 AE中克隆形成。 目前已经被广泛用于高效表达外来蛋白制品。
基因工程细胞的构建和筛选
真核细胞基因表达载体的构建
病毒载体
牛痘病毒
杆状病毒
质粒载体
允许载体在细菌体内扩增的质粒序列
有能使基因转录表达的调控元件
能用以筛选出外源基因已整合的选择标记
仅适合用于密切相关的突变细胞株
显性作用基因
带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞方法
融合法、化学法、物理法、病毒法
筛选
筛选系统、克隆纯化
细胞库的建立
原始细胞库
生产用细胞库
动物细胞的培养条件和培养基
基本条件
绝对无菌操作
足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量的离子掺入
适量氧气供应
随时清除细胞代谢中产生的有害产物
有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透压和离子浓度等
及时分种，保持合适的细胞密度
动物细胞的培养条件
器材的清洗和消毒
清洗 浸泡、刷洗、泡酸和冲洗
水质
p H
渗透压
温度
空气
动物细胞培养基的种类和组成
天然培养基
在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。
合成培养基
优点是成分明确，组分稳定，可大量生产供应。动物细胞培养中常用的有 BME、MEM、DMEM、HAM F12、RPMI1640以及ISOCOV、199和McCoy等。
无血清培养基
进行动物细胞培养材料
胚胎组织
成体组织
肿瘤组织
动物细胞培养的方法和操作方式
细胞系的分离培养
细胞计数
细胞传代
细胞冻存于复苏
动物细胞生物反应器及其检测控制系统
理想的动物生物反应器的基本要求
各种材料对细胞必须无毒性;
良好的传质、传热和混合性能
密封性能良好，可避免外来微生物的污染;
对物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一
可长期连续运转;
容器加工制造时要求内面光滑，无死角;
拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作维修;
设备成本尽可能低。
动物细胞生物反应器的类型及其基本结构
搅拌式生物反应器
气升式生物反应器
中空纤维式生物反应器
透析袋或膜式生物反应器
固定床或流化床式生物反应器
一次性生物反应器
动物生物反应器的检测控制系统
培养过程中需要控制的物化参数
直接在线检出
取样离线检出
检测后计算
主要参数控制法
温度
p H
溶氧
搅拌
进出液流量
其他
动物细胞培养操作方式
分批培养
半连续式培养
贯流式培养
动物细胞制药的前景和展望
改进表达载体，提高表达水平和产量
利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本
抑制细胞凋亡，延长培养周期
采用糖基化工程，提高产品质量
转基因动物的研究
组织工程的研究
抗体制药
概述
经验免疫学时期
经典免疫学时期
牛痘发明
减活疫苗发明
抗体发现
近代免疫学时期
现代免疫学时期
单克隆抗体
应用
用于疾病的诊断和治疗
作为载体制备导向药物
问题
鼠源性单克隆抗体的免疫原性
完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度
解决办法
降低单克隆抗体的免疫原性
降低单克隆抗体的相对分子质量
单克隆抗体及其制备
抗原与动物免疫
制备用于动物免疫的适当抗原
化学合成抗原
多数情况下抗原物质只能得到部分纯化，甚至是极不纯的混合物
通过克隆化选出最适当的单克隆抗体
稳定的杂交瘤的获得
免疫方法
体内免疫法
体外免疫法
细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合基本方法
取适量脾细胞与骨髓瘤细胞进行混合，在聚乙二醇(PEG)作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。
用于融合的骨髓瘤细胞应具备条件
融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。
诱导剂PEG的影响
分子量及浓度越大，促融率越高，但其粘度和对细胞的毒性也随之增大。目前常用的PEG的浓度为40%-50%，相对分子质量以4000为佳。
培养基的正确选择
常用的选择培养基为HAT培养基，它是次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)配制的。
选择性培养方法
饲养细胞
常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。
筛选阳性克隆与克隆化
筛选阳性克隆
用的检测方法有免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术等。
克隆化
有限稀释法
软琼脂法
杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
杂交瘤细胞的鉴定
杂交瘤细胞的染色体在数目上接近两种亲本细胞染色体数目的总和，在结构上除多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。
染色体数目较多又比较集中的杂交瘤细胞能稳定分泌高效价的抗体，而染色体数目少且比较分散的杂交瘤细胞分泌抗体的能力较低。
抗体性状的鉴定
进行免疫扩散
ELISA法
单克隆抗体的大量制备
体外培养法
获得10ug/m1的抗体
动物体内诱生法
可获得5-20mg/ml的抗体。
单克隆抗体的纯化
澄清和沉淀处理
分离
凝胶过滤
用于IgG和IgM类单克隆抗体的分离纯化
阴离子交换层析
用于IgG类单克隆抗体的分离纯化
亲和层析
多用蛋白A亲和层析，适用于IgG类单克隆抗体的纯化
离子交换法
在最适离子强度及pH条件下，以离子交换层析分离单克隆抗体可以纯化25-100倍。
鼠源性单克隆抗体的改进
目的
降低免疫原性
降低相对分子量，增加组织通透性
种类
人-鼠嵌合抗体
改形抗体
小分子抗体
Fab抗体
Fr抗体
单链抗体单域抗体
双功能抗体
化学交联法
生物学方法
抗体融合蛋白
配基-配基型融合蛋白
配基-Ig嵌合型蛋白
配基-FV型嵌合蛋白
受体-FV型融合蛋白
酶-抗体型融合蛋白。
抗体工程和基因工程抗体
噬菌体抗体库技术的基本方法
获得目的基因
抗体库技术的载体
淘筛
表达与鉴定
噬菌体抗体库技术的特点
模拟天然全套抗体库
避开了人工免疫和杂交瘤技术
可获得高亲和力的人源化抗体
基因工程抗体的表达
原核细胞表达
真核细胞表达
转基因植物表达
转基因动物表达
抗体诊断试剂
血清学鉴定抗体制剂
免疫标记技术用的抗体制剂
体内导向诊断抗体制剂
抗体治疗药物
放射性核素标记的抗体治疗药物
抗癌药物偶联的抗体药物
毒素偶联的抗体药物
植物细胞工程制药
概述
基本概念
植物组织和细胞培养
无菌培养
植物培养
愈伤组织培养
悬浮培养
器官培养
胚胎培养
悬浮培养
细胞培养
分生组织培养
外植体
器官形成
无性繁殖
突变体
继代培养
植物细胞培养的发展简史
Schleiden和Schwann提出了细胞学说;
20世纪初，德国著名植物学家Haber landt依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞的观点;
植物细胞的形态和生理特性
植物细胞的形态
植物细胞的形态多种多样，随植物种类、存在部位和功能的不同而异。
植物细胞的结构特征
原核细胞
真核细胞
细胞后含物
生物碱
是一类含氮的有机化合物，广布于植物界。
糖苷类
是指某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物
挥发油
是一类具有芳香气味，在常温下易于挥发的油类
有机酸
是糖类代谢的中间产物。
生理活性物质
酶、维生素、植物激素和抗生素
植物培养细胞的生理特性
延迟期
加速期
对数期
稳定期
植物细胞培养的基本技术
植物材料锇准备
培养基及其组成
无机盐
碳源
植物生长调节剂
有机氮源
维生素
培养方法
培养对象
原生质体培养和单倍体细胞培养
培养基类型
固体培养和液体培养
培养方式
悬浮细胞培养和固定化细胞培养
影响植物次级代谢产物累积的因素
生物条件
外植体
季节
休眠
分化
物理条件
温度
光(光照时间、光强、光质)
通气(O2)
pH和渗透压
化学条件
无机盐(N、P、K等)
碳源
植物生长调节剂
维生素
氨基酸
核酸、抗生素、天然物质、前体
工业培养条件
培养罐类型
通气
搅拌
培养方法
植物细胞培养的生物反应器
通气和搅拌系统
摇瓶
搅拌型生物反应器
环流生物反应器和鼓泡塔生物反应器。
植物细胞大规模培养的生物反应器
机械搅拌式生物反应器
鼓泡塔生物反应器
气升式生物反应器
转鼓式生物反应器
固定化细胞生物反应器
各种生物反应器性能比较
进展与展望
诱导子
前体饲喂
莽草酸
属芳香化合物，是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体:
氨基酸
形成生物碱及肽类抗生素类，包括青霉素类和头孢菌素类;
乙酸
聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素类、多酚类、类异戊二烯等的前体。
两相法培养系统
添加的固相(如树脂)或液相对细胞无毒害作用，不影响细胞生长和产物的合成;
产物易被固相吸附或被有机相溶解
两相易分离
如为固相，不可吸附培养基中的添加成分，如植物生长调节剂、有机成分等。
毛状根和冠瘪瘤培养
酶工程制药
概述
酶的特性
催化效率高
专一性强
反应条件温和
催化活性受到调节和控制
酶工程简介
酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。
酶工程主要研究内容
酶的分离、提纯、大批量生产及应用开发酶和细胞的固定化及酶反应器的研究。
酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶(突变酶)的研究。
酶的分子改造与化学修饰以及酶的结构与功能之间关系的研究。
有机相中的酶反应研究。
酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究。抗体酶、核酸酶的研究。
模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。
酶的来源和生产
酶的来源
植物提供的酶
蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。
动物组织提供的酶
胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的凝乳酶等。
酶的生产菌
对菌种的要求
繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求而且最好是产生胞外酶的菌。
不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。
产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体
能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
生产菌的来源
从菌种保藏机构和有关研究部门获得。
从自然界中分离筛选
目前常用的产酶微生物
大肠杆菌
其遗传背景清楚， 可被广泛用于遗传工程改造成为外来基因的宿主，而成为食性状的“工程菌”。
枯草杆菌
是工业上应用最广泛的产酶菌之一，主要用于发酵生产淀粉酶、β一葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等。
啤酒酵母
生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。
曲霉(黑曲霉和黄曲霉)
糖化酶、蛋白淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基琵花酶和脂肪酶等。
固定化酶的制备
固定化酶的定义
固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。
固定化酶的特点
可多次使用
反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。
反应条件易控制
酶的利用效率高。
比水溶性酶更适合于多酶反应。
酶和细胞固定化方法
载体结合法
物理吸附法
离子结合法
共价结合法
交联法
物理吸附法
无机载体一活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等;
天然高分子载体-淀粉、谷蛋白等;
其他一大孔树脂、陶瓷等，具有疏水基的载体(丁基或己基 葡聚糖凝胶)
离子结合法
共价结合法
包埋法
网格型
微囊型
选择性热变性法
酶和细胞的固定化载体
吸附载体
包埋载体
共价结合载体
固定化酶制备技术
吸附法制备固定化酶技术
包埋法制备固定化酶技术
界面沉降法
界面聚合法
交联法制备固定化酶技术
共价结合法制备固定化酶技术
固定化细胞的制备
固定化细胞的定义
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。
固定化细胞的特点
无须进行酶的分离纯化
保持酶的原始状态，酶回收率高
比固定化酶稳定性高
细胞内酶附助因子可再生
细胞本身含多酶体系
抗污染能力强
固定化细胞的制备技术
载体结合法
是将细胞悬液直接与水不溶性的载体 相结合的固定化方法。
包埋法
将细胞定位于凝胶网格内的技术。
交联法
用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法
无载体法
靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。
固定化方法与载体的选择依据
固定化方法的选择
固定化酶应用的安全性
固定化酶在操作中的稳定性
固定化的成本
载体的选择
固定化酶的形状与性质
固定化酶的形状
颗粒状固定化酶
纤维状固定化酶
膜状固定化酶
管状固定化酶
固定化酶的性质
酶活力的变化
酶稳定性的变化
操作稳定性
贮藏稳定性
热稳定性
对蛋白酶的稳定性
酶学特性的变化
底物专一性
最适pH
最适温度
米氏常数
最大反应速度
固定化酶活力的测定方法酶活力
分批测定法
连续测定法
固定化酶和固定化细胞的反应器
反应器的类型和特点
间歇式搅拌罐反应器
连续流动搅拌罐反应器
添充床反应器
流化床反应器
续流动搅拌罐-超滤膜反应器
循环反应器
其它反应器
反应器的选择依据
根据固定化酶的形状来选择
根据底物的物理性质来选择
根据反应的动力学特性来选择
根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择
根据操作要求及反应器费用来选择
酶的人工模拟
模拟酶的概念
所谓人工模拟酶就是指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶相对简单。
模拟酶的分类
主-客体酶模型
环糊精
胶束模拟酶
肽酶
半合成酶
以具有酶活性的蛋白为母体，在其活性中心引入催化功能部分;
利用天然蛋白进行构象修饰，创造新的酶活性中心。
印迹酶
酶的化学修饰
酶化学修饰的概念
酶化学修饰的目的和意义
提高生物活性(包括某些在修饰后对效应物反应性能的改变)
增强在不良环境(非生理条件)中的稳定性
针对异体反应，降低生物识别能力
化学修饰的措施
修饰酶的功能基团
酶分子内或分子间进行交联
修饰酶的辅因子
酶与高分子化和物相结合
修饰酶的特性
热稳定性提高
抗各类失活因子能力提高
抗原性消除
体内半衰期延长
最适改变
酶学性质变化
对组织分布能力改变
酶工程研究的进展
有机相的酶反应
增加疏水性底物或产物的溶解度。
热力学平衡向合成方向移动，如酯合成、肽合成等。
可抑制有水参与的副反应，如酸酐的水解等。
酶不溶于有机介质，易于回收再利用。
容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。
酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大。
无微生物污染。
能测定某些在水介质中不能测定的常数。
固定化酶方法简单，可以只沉积在载体表面。
核酶和脱氧核酶
具有催化活性的RNA,称为核酶。
具有催化活性的DNA,称为脱氧核酶。
抗体酶
发酵工程制药
概述
发酵的定义
传统发酵
生化和生理学意义的发酵
工业上的发酵
发酵工程制药的研究范畴
抗生素
维生素
氨基酸
核苷或核苷酸
药用酶和辅酶
其它药理活性物质
发酵工程的4个阶段
第一阶段
1676年制成第一台显微镜--微生物的存在
1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的
1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精--酶
第二阶段
发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于 厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。
第三阶段
20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素迅速工业大规摸生产。
深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。
第四阶段
20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。
20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。
20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合技术等高新技术应用阶段。
发酵工程的组成
上游工程
发酵工程
下游工程
微生物发酵类型
微生物菌体发酵
微生物酶发酵
微生物代谢产物的发酵
初级代谢产物
刺激代谢产物
微生物转化发酵
发酵工程制药的特点
微生物菌种选育获得高产
发酵的理论产量存在约10%的变量
发酵过程常温常压，操作条件温和
纯种培养、无菌条件
生产过程是以生物体的自动调节方式进行的
分子水平生产，定向发酵、突变 杂交等手段
投资少、见效快
发展趋势
利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、新的工程菌和新型微生物的开发
新型的生理活性多肽和蛋白质类药物:干扰素、白介素促红细胞生成素等
新型菌体制剂和疫苗
发酵制药中的微生物
常见的制药微生物
细菌
大肠杆菌属
短杆菌属
棒状杆菌属
芽孢杆菌属
假单胞菌属
乳酸杆菌属
放线菌
链霉菌属
诺卡氏菌属
小单胞菌属
真菌
根酶属
曲霉属
青梅属
头孢菌属
酵母菌属
发酵菌种的选育要求
生产力
能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少。
操作性
培养条件简单，发酵易控制，产品易分离。
稳定性
抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化。
安全性
非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素。
菌种选育
自然选育
诱变育种
杂交育种
原生质体融合
基因工程
菌种保藏
斜面低温保藏法
石蜡油封存法
砂土管保藏法
麸皮保藏法
甘油悬液保藏法
冷冻真空干燥保藏法
液氮超低温保藏法
宿主保藏法
发酵方式
分批培养
生长阶段
延迟期
指数生长期
静止期
衰亡期
影响因素
营养物质浓度
温度
pH值
溶解氧浓度
产物
连续培养
连续培养方法的优点
细胞生长速率较高
连续培养可发使得培养液达到一个稳定状态
连续培养方法的缺点
连续培养延续的时间长，发生杂菌污染的概率就增加
长时期进行连续培养，细胞发生变异、质粒丢失、基因突变
细菌株生产性能退化的现象也就比较突出
分类
单级连续培养
细胞回流式的单级连续培养
多级连续培养
其它培养方法
补料分批培养
透析培养
闪蒸培养
离子交换培养
萃取培养
发酵设备及消毒灭菌
发酵设备
发酵罐的类型
搅拌釜反应器
鼓泡式反应器
气升式反应器
发酵辅助设备
无菌空气系统
灭菌系统、管道、阀门
培养基及其灭菌
培养基
培养基的成分
碳源
氮源
无机盐
前体物
促进剂
抑制剂
培养基灭菌
空罐灭菌
实罐灭菌
连续灭菌
发酵工程制药过程与控制
发 酵 过 程
根据对氧的需要分:厌氧和有氧发酵。
根据培养基物理性状分:液体和固体发酵。
根据微生物生长特性分:分批发酵和连续发酵。
发酵过程中的中间分析项目
产物产量，ph，糖，氨基氮
发酵过程的影响因素及控制
菌体浓度，营养物质，温度，ph，溶氧，泡沫，染菌，发酵终点的判断
生产实例
抗生素类
按进行生产的微生物母体分
细菌生产的抗生素
霉菌生产的抗生素
放线菌生产的抗生素
按化学结构分
β -内酰胺类抗生素
氨基糖苷类
大环内酯类
四环素类
多肽类
生产制造实例
青霉素，链霉素
氨基酸类
L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-苯丙氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸，L-组氨酸
维生素类
VＣ，VVA VVD2 VVD3 VB1 VB2 VB12 VE
其它有机物与医药中间体
柠檬酸 乳酸 葡萄糖酸 醋酸 乙醇 丙酮 甘油
时间如雪
看不到图，只能看大纲啊