高级生物化学

蛋白质组学，蛋白质组学的一些技术

生物化学

• 蛋白质组
  • 一个基因组，一个生物，一个细胞或组织表达的所有蛋白质 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律
  • 蛋白质组学研究技术
    • 双向电泳技术的技术发展
      • 双向凝胶电泳技术（2DE)
        • IPG-DALT系统
          • 加样
          • 等电聚焦电泳IEF
            • ph稳定，依赖不同PK值得丙烯酰胺衍生物
            • 不依赖外加电场
          • 平衡
          • IPG固相PH梯度的发明和完善
          • SDS-PAGE
            • 灌胶
            • 第一向胶条的转移
            • 电泳
            • 染色
              • 考染
                • 考马斯亮蓝 (coomassie brilliant blue,CBB-250)染色是传统的蛋白染色方法,由于其所用试剂简单，操作简单、花费少，而且对质谱几乎没有任何影响，因而一直受到各国研究者的青睐。 考染缺陷 n 在2-DE中,由于其存在脱色过程,每一次脱色程度各不相同,从而导致CBB-250在2-DE中很难进行准确地定量分析。 n 对于蛋白质组分析来说其灵敏度显得较差,不足以检测胞内微量表达的蛋白。 n 染色液中含有三氯甲烷和乙醇,能导致蛋白质中的天冬氨酸和谷氨酸的羟基在酸的催化下,与醇发生酯化反应,该反应为不可逆反应,对蛋白质的肽质指纹谱产生严重干扰,为鉴定蛋白质带来一定的难度。 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色
              • 银染
                • n 目前流行的银染方法有两种:化学显色和光显色。 n 化学显色又可分为双胺染色和非双胺染色，又称为碱性二氨银法和酸性硝酸银法。 n 酸性硝酸银法对胞内恒量蛋白染色的灵敏度较低,但对酸性蛋白的灵敏度较高,故较适合于2-DE胶的染色。 n 碱性二氨银法由于NH4+易挥发,只适用于瞬时染色。 n 对碱性蛋白，银染也有着很弱的染色效果，因此银染不适合用于测定不同蛋白质的比例。
              • 荧光染
                • n 与蛋白非共价结构的荧光染料是一种较为理想的染色物质,主要是因为其灵敏度高、操作简便，且不影响蛋白的鉴定，因而受到越来越多的关注。 n SYPRO类染料： n     1、为含金属钌的螯合物, 对蛋白染色的灵敏度可达 pico-g级； n    2、对蛋白的鉴定毫无影响； n     3、对核酸等非蛋白成分不染色； n   4、低背景染色，不需长时间的脱色步骤
                • DIGE
                  • 双向荧光差异凝胶电泳（DIGE） n DIGE 技术的优点在于   (1) 与传统的2DE 方法相比,两种样品同一块胶分离，重复性大大提高,比较模式简化;   (2) 在同一块胶上观察两组蛋白质样品的差异表达更精确直观:可以很精确地看出丰度改变;   (3) 荧光染色在4 个数量级的范围内可以进行蛋白质点(带) 定量,动态范围更宽;   (4) 所需的染色时间短（标记45min）,   (5) 荧光标记不会影响质谱(MS) 分析结果,因为只有一小部分样品分子被标记,并且在质谱的检测范围内观测不到被标记蛋白的肽段。 n DIGE 技术的缺点   1、标记方法只适用于含有赖氨酸的蛋白质;对于赖氨酸含量少的蛋白质标记有一定的困难。    2、DIGE 标记后的蛋白质在胶上向高分子区移动,分子质量大约增加015 u ,p I 值不改变。 因为只有一小部分蛋白质被标记,大部分蛋白质在Cy3 、Cy5 标记的谱图上看不到,所以未被DIGE 标记的蛋白质可进一步通过荧光染料SYPRORuby 染色确认
            • 干胶
      • 色谱
        • 纸层析
          • 原理 滤纸一般能吸收22%-25%的水，其中6%-7%的水是以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，一般情况下较难脱去。纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。
        • 分子筛层析
          • 原理：凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。
        • 离子交换层析
          • 原理 1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合 2.吸附阶段：样品与反离子进行交换 3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质
        • 亲和层析
          • 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性
        • 聚焦层析
          • 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH 时被洗出。在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。
    • 生物质谱
      • 质谱
      • 质谱仪
        • 进样装置
        • 离子化源
          • 机制辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF)
            • n MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。
          • 电喷雾质谱（ESI-MS）
            • 电喷雾电离利用位于一根毛细管和质谱仪进口间的电势差生成离子，在电场的作用下产生以喷雾形式存在的带电液滴，当使用干燥气或加热时，溶剂蒸发，液体体积缩小，最终生成去溶剂化离子。 特点： 1.可生成高度带电的离子而不发生碎裂，通过检测带电状态，可计算离子的真实分子量。同时，解析分子离子的同位素峰也可确定带电数和分子量，因同位素峰间的质荷比差与带电数相对应； 2.多肽离子带有多个电荷，在较小的m/z范围内可以检测大分子质量范围的分子(100,000Da)。 3.由于采用液相方式进样，可与高效液相色谱等方法联用分离多肽混合物。 4.nanospray技术降低样品用量，提高检测灵敏度。
        • 质量分析器
          • 时间
            • 离子阱质量分析器（IT）分辨率高，线性低，准高分辨质谱仪，用于判断质谱峰带的电荷数
            • 飞行时间质量分析器（TOF）：质量范围宽，扫描速度快，灵敏度高
            • 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（FT-MS） ：分辨率极高，分析灵敏度高 线性高
          • 空间
            • 四极杆质量分析器分辨力低，线性好，不属于高分辨质谱仪
            • 双聚焦分析器：分辨率高，但扫描速度慢，操作、调整比较困难，价格高
        • 离子检测器
        • 数据分析系统
    • 蛋白质生物信息学的兴起
      • 肽质量指纹图谱（PMF)
        • 肽质量指纹谱是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段图谱。
        • 特点
          • 使用2DE-MALDI-TOF，费用低廉
          • 所鉴定蛋白质序列必须已知
          • 不适用于3种蛋白以上的混合物
          • 灵敏度不高，肽段缺失导致没有结果
          • 精确性不高
          • 2DE中只有大约40%的点能得到鉴定
    • 定量方法
      • 染料染色+2D gel
      • 荧光染料：Cy2,Cy3,Cy5; SYPRO Ruby
      • 化学修饰+MS 检测
      • 同位素标记（ICAT)
        • 优点： 优点 n ⑴能够兼容分析任何条件下体液、细胞、组织中绝大部分蛋白质； n ⑵烷化反应即使在盐、去垢剂、稳定剂（如SDS、尿素、盐酸胍等）存在下都可进行； n ⑶只须分析含Cys残基的肽段，从而降低了蛋白质混合物分析的复杂性； n ⑷ ICAT战略允许任何类型的生化、免疫、物理的分离方法，因此能很好地定量分析微量蛋白质。 缺点 • （1）D0和D8标记的ICAT试剂虽然差别很少，但标记上它们的肽段在色谱行为上有一定的区别，出锋时间有细微差异，因此在液相色谱-质谱联用时给质谱检测和定量带来了一定的困难。 • • （2）ICAT的分子量约为500 Da，很大的修饰物会增加数据库搜索算法的复杂性；对其二级质谱碎片离子解析也增加了难度。 • （3）被标记的两个多肽相差8，对含有两个半胱氨酸的多肽相差16与氧化很难区分，对定量和鉴定都带来难度。 （4）这一方法无法分析不含Cys的蛋白质。
  • 基因组和蛋白质组
    • 同一性和多样性
      • 基因组的同一性 作为遗传信息的载体，基因组是不变的。知道了个体内某一细胞内的基因组就等于知道了该个体所有细胞的基因组。 蛋白质组的多样性 作为生命活动的主要执行者，对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的活动状态下，蛋白质组的构成是不一样的。
    • 静态和动态
      • 基因组： 一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。 蛋白质组： 作为新陈代谢的主要执行者，在个体的生命活动中总是变动不停。 衍生“差异蛋白质组学”研究
    • 时间和空间
      • 基因组研究：      DNA通常位于细胞核内，且保持稳定，所以DNA序列不受时间与空间的影响；     mRNA在发育的不同阶段，表达是不一致的，在研究转录组时必须考虑到时间，但可以不考虑空间。 蛋白质组研究： 在不同的细胞周期，蛋白质的表达量是变化的；不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们所行使的功能也是不同的。 蛋白质组的研究不仅要考虑时间，更要考虑其空间的影响。 衍生“亚细胞蛋白质组学”研究
    • 互补互助
      • 基因组研究： 基因组既无量的变化，也无质的变化，因此DNA测序是一个最基本、最主要的工具。 蛋白质组研究： 蛋白质组的分析既涉及量的不同，也涉及质的不同， 包括分离技术和鉴定两大技术。 分离技术：细胞分级分离、 2DE、2D-LC等 鉴定技术：质谱、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术等。
    • 单一方法和多种技术
      • 基因组研究： 基因组既无量的变化，也无质的变化，因此DNA测序是一个最基本、最主要的工具。 蛋白质组研究： 蛋白质组的分析既涉及量的不同，也涉及质的不同， 包括分离技术和鉴定两大技术。 分离技术：细胞分级分离、 2DE、2D-LC等 鉴定技术：质谱、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术等。
    • 孤立和相互作用
      • 基因组： 基因组的基因表达的各种mRNA是彼此孤立的，互不干扰。 蛋白质组： 蛋白质彼此间存在广泛的相互作用，不存在不与其它蛋白质发生作用的孤立蛋白质。 衍生“蛋白质相互作用网络”分析
    • 有限和无限
      • 基因组研究： 测定所有的DNA碱基序列。 要测定的基因组，不论大小，其核苷酸的数量是明确的。（人类基因组：32亿个碱基对） 蛋白质组研究： 测定基因组基因所表达的全部蛋白质。 细胞内的蛋白质大多数进行过翻译后修饰。蛋白质组的数量是不确定的。 （人类蛋白质组的蛋白质种类估计20万-200万）
• 样品的制备
  • 原则
    • 尽可能是样品溶解
      • 表面活性剂CHAPS
      • 还原剂DTT
      • 两性载体电解质IPG BUFFER
    • 尽可能减少人为修饰
    • 使蛋白质处于完全变性状态
      • 解离剂（尿素和硫脲）
  • 细胞破碎处理方法
    • 化学
    • 机械
      • 超声波
      • 研磨式匀浆器
      • 切割式匀浆器
  • 目标
    • 去除高丰度蛋白质，提高对低丰度蛋白质的检测； 降低体液样品中的盐浓度，提高等电聚焦效果； 尽可能分成多个组分，富集低丰度蛋白质、提高分辨率。
• 氢键，范德华力，离子键，疏水相互作用
• 基因组
  • 包含生物体全套遗传信息的全部遗传物质