导图社区 常见分子生物学技术原理与应用
常见分子生物学技术原理与应用知识梳理,包括分子杂交与印迹技术、PCR、基因文库、生物芯片、大分子相互作用等等。
这是一篇关于医学遗传学-免疫缺陷的思维导图,详细解释了ABO血型系统的遗传基础,包括“IAB”、“IB”、“H”等基因和它们编码的“N-乙酰半乳糖胺转移酶”、“D-半乳糖转移酶”等蛋白质的功能。讨论了人类白细胞抗原(HLA)系统,这是一组位于人体有核细胞表面的抗原,与免疫应答、器官移植等多个方面密切相关。HLA系统包括多个基因群,如I类、Ⅱ类和Ⅲ类基因,它们在人体中发挥着不同的作用。
这是一篇关于医学遗传学-线粒体疾病的思维导图,介绍了线粒体疾病的多种类型,按照生化分类分为底物转运缺陷、底物利用缺陷、Krebs循环缺陷和电子传递缺陷。详细描述了几个具体的线粒体疾病案例。首先是Leber视神经菱缩(LHON),这是一个由于mtDNA中的复合体IND4亚基基因在第11778位点的碱基从G变为A导致的遗传性疾病。讨论了mtDNA点突变或缺失如何选择性地破坏胰岛β细胞,从而与糖尿病相关。
这是一篇关于医学遗传学-多基因疾病的思维导图,列出了精神分裂症的一些主要症状,包括联想障碍、情感淡漠情感不协调、意志活动减弱或缺乏、幻觉妄想和紧张症等。这些症状构成了精神分裂症的核心症候群,并且病人常常缺乏自知力。还提到了与这些基因相关的其他疾病,如青少年型糖尿病(I型DM)和哮喘。列出了与神经系统疾病相关的其他基因和疾病,如帕金森病(与PARK2、SNCA等基因相关)和阿尔兹海默症(与APP、PSEN1等基因相关)。
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常见分子生物学技术原理与应用
分子杂交与印迹技术
探针技术
探针:带有特殊可检测标记的核酸片段
探针标记物
放射性核素
生物素
荧光染料
印迹技术
DNA印迹
Southern blotting
基因组DNA定性定量分析
RNA印迹
Northern blotting
检测某一组织或细胞中已知的特异的mRNA表达水平,也可以比较不同组织和细胞中同一基因的表达情况
蛋白印迹
Western blotting,免疫印迹
检验蛋白存在,半定量分析、蛋白质分子相互作用研究
斑点印迹
不经电泳分离而直接将样品点在NC(硝酸纤维素)膜上用于杂交分析
原位杂交
组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析
PCR
成分
模板DNA,引物,热稳定DNA聚合酶、dNTP、以及含有Mg2+的缓冲液
步骤
1||| 变性:94℃
2||| 退火:一般较Tm低5℃
3||| 延伸:温度升至72℃
4||| 循环:25~30次
主要用途
基因的体外克隆
基因的体外突变
改造引物
DNA和RNA微量分析
DNA序列测定
基因突变分析
与其他技术结合
PCR衍生技术
逆转录PCR:RT-PCR
RNA定性与半定量分析
原位PCR
在甲醛溶液固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行PCR反应,然后用特异性探针进行原位杂交
将目的基因的扩增与定位相结合
实时定量PCR
非探针类实时定量PCR
SYBR Green
结合在DNA双螺旋小沟区域。游离状态时荧光信号强度低,一旦与双链DNA结合,荧光信号强度大大增加,而荧光信号强度与结合的双链DNA的量成正比
探针类实时定量PCR
大大提高特异性
TaqMan探针法
TaqMan探针5'-端有一个荧光报告基团R,3'-端有一个荧光猝灭基团Q。没有扩增反应时,探针完整,RQ同时存在于探针上,无荧光信号释放。
随着PCR反应的进行,TaqDNA聚合酶在链延伸时遇到荧光探针,其5'→3'核酸外切酶活性可以将探针逐步切断,R与Q分离,产生荧光信号
TaqMan探针属于水解性探针,一旦R与Q分离便会一直存在于体系中被检测,因此TaqMan探针法检测的是累计荧光,是不可逆的
分子信标探针法
探针也有RQ,但探针不结合时是发夹结构,荧光猝灭,探针结合时发出荧光
FRET探针法
双杂交探针,light cycle探针
由两条能与DNA特异性结合且相邻的探针组成,上游探针3'-端带荧光供体基团,下游探针5'-端标记Red640荧光受体基团
DNA复性时,探针结合DNA,基团靠近,发出荧光,变性时不能检测到荧光
FRET探针法检测的是实时信号,是可逆的
FRET探针法在突变分析、SNP基因分型等方面更具优势
基因文库
定义:指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体
基因组文库
cDNA文库
构建
纯化的细胞基因组DNA用适当的限制性内切酶消化,获得一定大小的DNA片段
片段克隆到噬菌体载体中,获得一群含有不同DNA片段的噬菌体
噬菌体基因组文库经过体外包装再转化细菌可获得扩增
载体
λ噬菌体
黏粒
酵母人工染色体
生物芯片
基因芯片
将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上,然后与待测的荧光标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统对芯片进行扫描,通过计算机系统对每一位点荧光信号做出检测、比较和分析,从而迅速得出定性和定量结果
=DNA微阵列
蛋白质芯片
探针蛋白固定于固相支持物上
大分子相互作用
蛋白质相互作用
标签蛋白沉淀
纯化的融合蛋白做标签,与待检测蛋白结合,然后用可结合蛋白标签的琼脂糖凝珠将融合蛋白沉淀回收,然后电泳分离并染色
最常用的标签是谷胱甘肽S-转移酶(GST),GST与共价偶联了谷胱甘肽的琼脂糖凝珠结合而纯化
酵母双杂交系统
DNA结合区BD
促进转录的活性区AD
应用
证明已知序列的蛋白质可以相互作用
分析已知相互作用蛋白相互作用的结构域或关键氨基酸残基
筛选未知相互作用蛋白
DNA与蛋白质相互作用
电泳迁移率变动分析
DNA结合蛋白与特定的DNA探针片段结合会增大其分子量,凝胶中电泳速度会慢于游离探针,表现为条带相对滞后
染色质免疫沉淀技术
CHIP
活细胞状态下化学交联试剂固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切成一定长度范围的染色质小片段,通过免疫学方法沉淀复合物,进而分析片段DNA的信息