第15章：重组DNA技术

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

第15章 重组DNA技术

• 相关概念
  • 又称为基因克隆、分子克隆或基因工程
  • 载体
    • 分类
      • 克隆载体：用于外源DNA片段的克隆和扩增
      • 表达载体
        • 用于外源基因的表达
        • 含有启动子（TATA盒、Pribnow盒）
    • 条件
      • 稳定自主复制
      • 多个限制性内切酶的单一位点，易于外源基因插入
      • 具有易检测的遗传标记
    • 常用载体
      • 质粒
      • 噬菌体
      • 病毒
    • 本质：DNA
• 基本步骤
  • 1.分
    • 获取目的基因
      • • 引物设计原则
          • 上游与编码连正向相同
          • 下游与编码连反向互补，与模板链正向相同
          • 长度18~24bp
          • GC含量50%左右
          • 5'可引入不匹配序列，3'严格匹配
            • 引入与载体相匹配的酶切位点
            • 制造点突变
            • 引入标签序列
            • 引入翻译起始和终止密码子
        • 模板的来源
          • 已构建成功的重组DNA分子
          • 组织或细胞中的cDNA
          • 基因组DNA
        • PCR
          • 过程
            • 变性
            • 退火
            • 延伸
          • 要素
            • 引物
            • dNTP、模板DNA、Mg2+
            • Taq DNA聚合酶
  • 2.切
  • 3.接
    • 粘性末端DNA片段连接
      • 同一限制性酶切位点连接
    • 平端DNA片段间连接
    • 黏平末端DNA片段间的连接
  • 4.转
    • 转化：导入细菌
      • 氯化钙转化法
        • 感受态:细菌处于容易吸收外源DNA的状态，这种细菌叫感受态细胞
      • 电穿孔法
      • 体外包装感染法
    • 转染：导入哺乳动物细胞
    • 感染：病毒载体介导外源基因整合宿主细胞过程
  • 5.筛
    • 根据重组载体标志作筛选
      • 抗性基因
      • 插入失活
      • α互补原理
      • 标志补救筛选
    • PCR法
    • 限制性核酸内切酶法、核酸杂交法、免疫学方法、核苷酸序列测定
  • 6.表达
• 工具酶
  • 限制性核酸内切酶
    • 回文结构
    • 最常用——Ⅱ类限制性核酸内切酶