思维导图 天然药物化学

黄酮化合物大多存在于高等植物及蕨类植物中，藻类、微生物（如细菌）中没有；黄酮类化合物属于植物次生代谢产物，其 中具药用价值者很多。

黄酮类化合物

• 概述
  • 黄酮化合物大多存在于高等植物及蕨类植物中，藻类、微生物（如细菌）中没有；黄酮类化合物属于植物次生代谢产物，其 中具药用价值者很多
  • 含黄酮类化合物中药实例：黄芩、槐花、陈皮、
• 黄酮类化合物的结构类型
  • 定义
    • 1952年之前：黄酮类化合物主要是指基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物，多为黄色，且结构中含酮基，故称黄酮
    • 现代：黄酮类化合物是指由两个苯环（A环与B环）通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物，即由C6-C3-C6单位组成的化合物
    • 黄酮类混合结构中常连接的基团：-OH、CH3- 、CH3O- 、萜类侧链等
    • 天然黄酮类化合物的分类：依据中央三碳链的氧化程度（C2, C3是否为双键、C4是否为羰基等）、B环的连接位置（C2或C3）、三碳链是否构成环状等分为黄酮、二氢黄酮、黄烷醇、异黄酮、查耳酮及特殊黄酮（如鱼藤酮类等）
      • 黄酮类和黄酮醇类
        • 黄酮类：具有2-苯基色原酮母核的化合物；常见化合物有芹菜素、木犀草素（存在于忍冬藤、菊花、浮萍中，具有抗菌作用）等；分布于芸香科、菊科、玄参科、豆科等植物之叶、花、枝、果实、根及根皮中；实例有黄芩素（存在黄芩中，具三酚结构，空气中易被氧化成绿色）、甘草黄酮A（甘草）
        • 黄酮醇类：为2-苯基色原酮-3-醇的衍生物；常见化合物有山奈酚、槲皮素（具抗炎、止咳祛痰、降血压、降血脂等作用）等；主要分布于蔷薇科、豆科、桑科、桦木科等双子叶植物中；实例有淫羊藿中的淫羊藿苷、槐米中的芦丁（槲皮素-３-O-芸香糖苷，用于治疗毛细管脆弱引起的出血病，并用作高血压辅助治疗剂）等
      • 二氢黄酮类和二氢黄酮醇类
        • 二氢黄酮类：具有 2-苯基-2,3-二氢色原酮基本母核的化合物；结构特点是有一个不对称碳原子C2，且多为2S-构型，2R-构型较少；分布于蔷薇科、芸香科、菊科、姜科等；常见化合物有苦参醇A、甘草苷、橙皮苷等；实例有大豆素（大豆）、甘草苷（甘草）
        • 二氢黄酮醇类：具有 2-苯基-2,3-二氢色原酮-3-醇基本母核的化合物；结构特点是有两个不对称碳原子C2与C3，且天然二氢黄酮醇类化合物最常见的构型为（2R，3R）；分布于豆科、桑科、蔷薇科等；常见化合物有二氢槲皮素（满山红叶中）；实例有水飞蓟素（二氢黄酮醇与苯丙素衍生物缩合成的黄酮木脂素类成分，具保肝作用，用于治疗急、慢性肝炎及肝硬化，代谢中毒性肝损伤等）
      • 异黄酮类：是 3-苯基色原酮的衍生物，系黄酮类化合物中非常独特的亚类；主要存在于豆科的蝶形花亚科中，含羞草亚科、菊科、防己科中亦存在；类型包括异黄酮类、二氢异黄酮类、异黄烷醇类、鱼藤酮类、紫檀素类等；常见化合物有大豆素（葛根、射干、大豆）、鸢尾苷（射干）、葛根素（葛根）等
        • 紫檀素类的基本骨架是由异黄酮的C4-位与C2’-位通过醚键环合而成的四环系统，有2个不对称碳原子 C6a与C11a，紫檀素类编号独特，其化合物数量在异黄酮家族中仅次于异黄酮
        • 鱼藤酮类是一类特殊异黄酮类化合物，其在C环上多1个碳原子取代，与B环形成含氧杂环，鱼藤酮类骨架编号与传统黄酮类不同，且结构上多数含有异戊烯基衍生的取代基
      • 查尔酮和二氢查尔酮类
        • 查尔酮类：分子骨架是由二氢黄酮的C环开环后形成，其母核碳原子编号与其他类黄酮不同，A环碳为1'~ 6'，B环碳为1~6；在结构上，查耳酮是苯甲酮缩苯乙酮化合物，为二氢黄酮异构体，两者因酸碱催化相互转化；主要存在于菊科、豆科中；常见化合物有异甘草素（甘草）等；红花苷是红花所含色素，是第1个被发现的查耳酮类植物成分
        • 二氢查尔酮类：在植物界分布较少，如蔷薇科中的根皮苷、次苦参醇素等
      • 黄烷醇类：结构特点是原黄酮化合物C环上，C4-羰基与C2、C3间双键被还原；天然的黄烷醇类包括黄烷-3-醇、黄烷-4-醇及黄烷-3，4-二醇；常见化合物类型有儿茶素类（系黄烷-3-醇衍生物，如儿茶素与表儿茶素）、原花青素类（由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，最简单的原花青素是由表儿茶素与儿茶素形成的二聚体，原花青素是植物中的一种色素成分，广泛存在于各种植物中，原花青素在酸性介质中受热均可产生花青素，原花青素属多酚类化合物，按聚合度不同，通常将2-5聚体称为低聚原花青素，简称OPC，将五聚体以上称为高聚原花青素，简称PPC
      • 花青素类：结构特点是母核为2-苯基苯骈吡喃烊盐；常见花青素有矢车菊素、飞燕草素、天竺葵素、锦葵花素等；在植物中，花青素多与糖结合成花色苷类。花色苷经水解可生成苷元（花青素）与糖；花青素类和花色苷类由于其离子形式和高度共轭的母核结构而呈现鲜艳颜色，使植物的花、果实、叶等呈蓝、紫、红等颜色
      • 𠮿酮类：即苯并色原酮，亦称占吨酮类或双苯吡酮类（属于特殊类型之黄酮）；主要类型有简单含氧取代𠮿酮类、𠮿酮木脂素类、异戊烯基𠮿酮类、𠮿酮苷等；实例有芒果苷（属𠮿酮碳苷）
      • 高异黄酮类：是一类由3-苄基色原酮衍生的化合物；高异黄酮与异黄酮无关，可能是由中间体2’-甲氧基查耳酮形成；实例有麦冬酮A
      • 双黄酮类：是由两分子黄酮类化合物骨架间通过C-C或C-O-C键直接相连形成的黄酮二聚体；多局限分布于裸子植物中，如银杏科、杉科、柏科、罗汉松科等；化合物实例有穗花杉双黄酮（卷柏）、银杏素（银杏叶）等
      • 其他黄酮类简介：黄酮木脂体类——如水飞蓟素等；黄酮生物碱——如榕碱、易榕碱等；新黄酮类——指结构上与生源上与黄酮类与异黄酮类相关的一类天然产物，新黄酮类化合物主要结构类型有4-芳基香豆素、4-芳基黄烷-3-醇类等；橙酮类——在中药中少见，较多存在于玄参科、菊科中，编号与其他黄酮类不同。如在黄花波斯菊花中含有的硫磺菊素属于此类
    • 天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，含单糖苷、双糖苷、 三糖苷等，其中糖的连接位置与黄酮苷元的结构类型有关，且除了O-苷外，尚存在黄酮C-苷（如葛根素等）
      • 黄酮苷的结构特点
        • 组成黄酮苷的糖类：单糖类（D-葡萄糖，D-木糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-葡萄糖醛酸等）、双糖类（槐糖,-龙胆二糖，芸香糖，新橙皮糖等）、三糖类（龙胆三糖，槐三糖等）
        • 糖的连接位置：O-糖苷——与苷元的结构类型有关，如黄酮醇类常形成3-、7-、3'-、4'-单糖苷或3,7-、3,4'-、7,4'-双糖链苷等；C-糖苷——6-位或8-位
• 黄酮类化合物的理化性质及显色反应
  • 性状
    • 状态：黄酮类多为结晶性固体, 少数（如黄酮苷类）为无定型粉末
    • 旋光性：黄酮苷元仅二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇因具手性碳原子而有旋光性，黄酮苷因含糖而有旋光性（多为左旋
    • 颜色：与黄酮分子结构中是否存在交叉共轭体系和助色团（如-OH、-OCH3）的种类、数目及其取代位置有关，交叉共轭体系（黄酮、黄酮醇及其苷类多显灰黄~黄色，查耳酮多显黄色~橙黄色，二氢黄酮、二氢黄酮醇及异黄酮无色，助色团效应（在黄酮、黄酮醇分子中，尤其在C7-、C4'-位引入-OH或-OCH3，因其促进电子转移、重排，可使黄酮化合物颜色加深，当助色团引入其他位置，则影响较小），花色素及其苷类的颜色随溶液pH变化（pH<7红色，pH=8.5紫色，pH>8.5蓝色 ）
  • 溶解性
    • 影响因素：与黄酮类化合物的结构有关，受黄酮类化合物的存在状态（苷或苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷）影响很大
    • 一般规律：游离苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚及稀碱水溶液，黄酮、黄酮醇与查耳酮难溶于水（因其分子平面性强，分子与分子间排列紧密，分子间引力较大），二氢黄酮与二氢黄酮醇等水溶性稍强（因其为非平面性分子，分子间排列不紧密，分子间引力降低，有利于水分子进入），花色苷元（即花青素）类水溶性较大（因其以离子形式存在，具盐的通性，故亲水性较强），黄酮苷元分子中引入-OH，将增加水溶性，当该羟基甲基化后，则增强其脂溶性；黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂，但难溶于苯、氯仿等有机溶剂，糖链越长，水溶性越大，糖的结合位置不同，对苷的水溶性亦产生一定影响
  • 酸性与碱性
    • 酸性：黄酮类化合物因分子结构中多具酚羟基，故显酸性，黄酮类可溶于碱性水溶液、吡啶、DMF等；酸性强弱顺序——7,4'-二羟基黄酮>7-或4'-羟基黄酮>一般酚羟基>5-羟基黄酮>3-羟基黄酮
    • 碱性：黄酮类化合物分子结构中，γ-吡喃酮环上的1-位氧原子存在未共用电子对，故可表现出微弱碱性，黄酮类化合物可与强无机酸（如浓盐酸、浓硫酸等）生成盐，但该盐极不稳定，加水即分解；黄酮类溶于浓硫酸，所生成的烊盐常表现出特殊颜色，用于黄酮结构类型鉴定
  • 显色反应：黄酮类化合物与各种试剂的呈色，多与结构中Ar-OH及γ-吡喃酮有关
    • 还原试验
      • 盐酸-镁粉（或锌粉）反应：方法——试样→溶于1mL甲醇或乙醇→加少许镁粉（或锌粉）→振摇→加几滴浓盐酸→1-2min内显色（必要时微热）；应用——确定黄酮化合物结构类型，因不同类型黄酮，显色不一样，多数黄酮（醇）与二氢黄酮（醇）类显橙红~紫红色（少数显紫色~蓝色），当黄酮（醇）与二氢黄酮（醇）类B环上存在-OH或-OCH3时，反应显色加深，查耳酮、橙酮、儿茶素类不显色，多数异黄酮不显色，花青素及部分橙酮、查耳酮等仅在纯浓盐酸作用下亦发生颜色变化（需做对照实验）；反应机制——黄酮类化合物遇HCl/Mg显色，乃生成花色素苷元或阳碳离子之故
      • 四氢硼钠（钾）反应：方法——试样→溶于0.1mL乙醇→加等量2%NaBH4甲醇液→1min后加数滴浓盐酸（或浓H2SO4）→显紫色~紫红色；应用——NaBH4是对二氢黄酮类化合物专属性较高的还原剂，反应后呈紫红色，其他黄酮类化合物均不显色；二氢黄酮与磷钼酸试剂反应呈棕褐色，该反应也可作为二氢黄酮类化合物的特征性鉴别反应
    • 金属盐类试剂的络合反应
      • 反应条件：能与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐等发生反应，且生成有色络合物的黄酮类化合物，其分子结构中常含下列体系之一——5-羟基、4-羰基体系，3-羟基、4-羰基体系，邻二酚羟基体系
      • 具体反应：铝盐——常用1%三氯化铝或亚硝酸铝，反应生成黄色络合物，且有荧光，用于定性及定量；铅盐——常用1%醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液，生成黄色~红色沉淀，沉淀颜色因黄酮羟基数目与位置不同而异，醋酸铅只能与符合结构要求的黄酮反应生成沉淀，碱式醋酸铅Pb(OH)2(Ac)4的沉淀能力比Pb(Ac)4大得多，可使一般酚类化合物沉淀；锆盐——黄酮化合物分子中含游离C3-OH或C5-OH者，与2%ZrOCl2甲醇溶液均可发生反应，生成黄绿色锆络合物，且有荧光，含游离C3-OH与含游离C5-OH的黄酮与ZrOCl2反应所形成的络合物，其对酸的稳定性存在较大差异[(3-羟基、4-羰基)黄酮锆络合物比（5-羟基、4-羰基）黄酮锆络合物在枸橼酸中更稳定]；镁盐——常用醋酸镁甲醇溶液为显色剂，方法是滤纸→加1滴供试液→喷醋酸镁甲醇溶液→加热干燥→紫外灯下观察现象，结果用于黄酮结构类型鉴定，如二氢黄酮、二氢黄酮醇类可显天蓝色荧光（具5-OH者，色泽更明显），黄酮、黄酮醇及异黄酮显黄色~橙黄色；氯化锶（SrCl2）——方法是1mg试样→1mL甲醇（必要时水浴加热助溶→加3滴0.01M氯化锶甲醇溶液→ 加3滴已用氨蒸汽饱和的甲醇→观察现象，结果是具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物，发生氯化锶反应，形成绿色~ 棕色~黑色沉淀；三氯化铁反应——三氯化铁水溶液或醇溶液为常用的酚类显色剂，结果是多数黄酮类化合物呈阳性（因分子结构中含酚羟基），一般仅在含有氢键缔合的酚羟基时，本反应才呈现明显的颜色，若反应不明显，可用三氯化铁-铁氰酸钾试剂（FeCl3-K3[Fe(CN)6]）显色
    • 硼酸显色反应：反应条件——黄酮类化合物需含（5-羟基、4-羰基）体系或为2'-羟基查耳酮类，结果是在酸性条件下，5-羟基黄酮及2'-羟基查耳酮类与硼酸反应，生成亮黄色（草酸存在下，反应显黄色，且有绿色荧光；枸橼酸-丙酮存在下，反应显黄色但无荧光）
    • 碱性试剂显色反应：方法——黄酮类乙醇溶液滴于滤纸上→干燥→喷Na2CO3水溶液或暴露于氨蒸气中（日光及紫外线下）→观察颜色变化；结果通常表现为颜色加深，以氨蒸气处理后呈现的颜色变化置空气中逐渐褪去（具可逆性），但经Na2CO3水溶液处理后加深的颜色置空气中却不褪色
      • 碱性试剂反应的其他应用：帮助鉴别黄酮类化合物分子中的某些结构特征——二氢黄酮类易在碱液中开环，转变成相应的异构体查耳酮类化合物，并显橙~黄色；黄酮醇类在碱液中先呈黄色，通入空气后变为棕色（因黄酮醇C3-OH易被氧化），籍此可与其他黄酮类区分开来；具邻二酚羟基结构的黄酮类在碱液中不稳定，易被氧化，生成黄色→深红色→绿棕色沉淀
  • Wessely-Moser重排：黄酮类C6-、C8-糖苷特性：其在常规酸性条件下不能发生水解，但可发生Wessely-Moser重排，糖基发生移位变成异构体，最后得到C6-和C8-糖苷混合物
• 黄酮类化合物的提取与分离
  • 提取
    • 黄酮化合物的存在——黄酮苷多存在于花、叶、果等组织中，黄酮苷元存在于植物木质坚硬组织中
    • 黄酮化合物粗提物的提取溶剂
      • 黄酮苷及极性稍大的黄酮苷元：用丙酮、乙酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂，常见极性较大的黄酮苷元包括羟基黄酮、双黄酮、橙酮及查耳酮等 ，黄酮类使用最多的提取溶剂是甲醇，黄酮类化合物使用最广的混合提取溶剂是甲醇-水（1:1），寡糖黄酮苷类的提取溶剂是沸水，花青素类用0.1%HCl水溶液；提取黄酮苷类成分过程中需注意两点——慎用酸水溶液进行提取，避免黄酮苷类水解，实际提取前，需优先破坏药材中酶的活性，以避免提取过程中黄酮苷类发生水解，采用25%以上乙醇、使用沸水、以石灰与药材混匀等进行提取
      • 大多数黄酮苷元：宜用极性较小的有机溶剂进行提取，如氯仿、乙醚、乙酸乙酯等，具多个含氧基的黄酮苷元用苯提取
    • 溶剂萃取法：用石油醚去除脂溶性色素——黄酮类化合物醇提液（粗提物，来自植物叶子）→石油醚→叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素被提取去除；以多倍量浓醇去除水溶性杂质——黄酮类化合物水提液（粗提物）→浓缩→多倍量95%乙醇→蛋白质、多糖等水溶性杂质被沉淀去除；溶剂萃取法的其他作用——去除杂质的同时，黄酮苷与黄酮苷元亦得到分离，还能将极性苷元与非极性苷元予以分离
    • 碱提取酸沉淀法：黄酮苷类虽具一定极性，能溶于水，但难溶于酸性水，易溶于碱性水（因结构中含酚羟基），故可用碱性水溶液提取，再将碱提液调至酸性，黄酮苷类即可沉淀析出；本法简单易行；实际应用于芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取（碱提酸沉法纯化芦丁，所用酸碱液浓度均不宜过高，因酸性过强，黄酮类化合物可能形成烊盐重新溶解，而在强碱性条件下，将破坏黄酮母核）
    • 炭粉吸附法：方法——（植物）甲醇粗提物→分次加活性碳→搅拌→静置→至上清液无黄酮反应→过滤（除去水溶性杂质）→黄酮苷被吸附于碳粉中→依次沸水、沸甲醇、7%酚/水、15%酚/醇洗脱→减压蒸发洗脱液至小体积→乙醚振摇去除残留酚→得含较纯黄酮苷成分之水层；主要适合于黄酮苷类的精制
  • 分离
    • 柱色谱法：常用吸附剂或载体：聚酰胺、硅胶、葡聚糖凝胶及纤维素粉等
      • 聚酰胺柱色谱
        • 优点：吸附容量大、分辨力强，聚酰胺是分离黄酮较理想的吸附剂，可分离各类黄酮化合物，包括苷与苷元、查耳酮与二氢黄酮等
        • 聚酰胺的吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子结构中羟基的数目与位置，以及洗脱溶剂与黄酮类化合物或聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小
        • 聚酰胺在水溶剂中的吸附规律：形成氢键的基团数目越多，吸附能力越强（当分子结构中酚羟基数目相同时，酚羟基所处位置对吸附强度亦产生影响）；苷元相同，所连接糖基越多，吸附力越弱，吸附能力为苷元 > 单糖苷 >双糖苷 >三糖苷；分子中芳香核、共轭双键多者，吸附能力较强；不同类型的黄酮化合物，吸附能力为黄酮醇 > 黄酮 > 二氢黄酮醇 >异黄酮
        • 溶剂影响聚酰胺吸附黄酮类化合物的能力：原因——聚酰胺对黄酮类化合物的吸附作用是在溶液中进行的，故溶剂将参加对吸附剂表面的争夺，或者通过改变聚酰胺对黄酮类成分的氢键结合能力来影响吸附过程；一般规律——聚酰胺在水中对黄酮的吸附能力最强，在含水醇中随醇浓度增高逐渐减弱，在高浓度醇或其他有机溶剂中几乎无氢键缔合
        • 聚酰胺柱色谱分离黄酮类化合物的过程：以水装柱→将待分离试样制成水溶液上柱（利于聚酰胺对溶质的充分吸附）→以不同浓度含水醇洗脱（不断提高醇的浓度，以增强混合溶剂洗脱能力）；甲酰胺、DMF及尿素水溶液因分子中含有酰胺基，可同时与聚酰胺柱及酚类成分等发生氢键缔合，故洗脱能力很强；水溶液中加入酸或碱均可破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合，故碱水或酸水也有很强的洗脱能力（常用于聚酰胺吸附剂的精制与再生）；各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力（由强至弱）——尿素水溶液>DMF>甲酰胺>氢氧化钠水溶液>丙酮>甲醇>水，常用混合洗脱剂为不同比例的乙醇-水
      • 葡聚糖凝胶
        • 常用葡聚糖凝胶型号：Sephadex G与Sephadex LH-20
        • 分离原理：分离黄酮苷元，主要依靠葡聚糖凝胶的吸附作用（吸附强弱程度取决于游离酚羟基的数目）；分离黄酮苷，则葡聚糖的分子筛性起主导作用，在洗脱时，黄酮苷类大体按分子量由大到小的顺序流出柱体
        • Ve/V0：代表洗脱剂洗脱倍数，其值越大，洗脱越难；反之，亦然
        • 常用洗脱剂：碱性水溶液、含盐水溶液、醇及含水醇、含水丙酮及甲醇-氯仿等
      • 硅胶色谱柱
        • 分离原理：硅胶为极性吸附剂，对极性较强的黄酮化合物吸附力较大（吸附牢，后洗出），对极性较弱者吸附力较小（优先洗出，Rf大）
        • 实际应用：本法使用最广，主要适合于分离中极性以下的黄酮类，如异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮与黄酮醇等，少数情况下，在加水去活性后，硅胶柱色谱法可用于分离极性较大的黄酮类化合物
        • 常用洗脱剂：氯仿-甲醇用于分离黄酮苷元，氯仿-甲醇-水（或乙酸乙酯-丙酮-水或乙酸乙酯-甲酸-水）用于分离黄酮苷
    • pH梯度萃取法
      • 使用范围：适合于分离酸性不同的黄酮苷元
      • 分离过程：黄酮苷元混合物溶于有机溶剂（如乙醚）→依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH、4%NaOH溶液萃取→实现分离
    • 其他方法
      • 铅盐沉淀法：中性醋酸铅用于具邻二酚羟基结构的黄酮化合物；碱式醋酸铅应用面更宽，尚可用于非邻二酚羟基结构的黄酮化合物
      • 硼酸络合法：适合于具有邻二酚羟基结构的黄酮化合物
      • 目前科研中有关黄酮类化合物的提取分离，多采用醇提取→系统溶剂萃取→色谱分离法，如黄酮化合物提取分离——植物药材→乙醇提取→浓缩得浸膏→加水分散→依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇等有机溶剂萃取→取乙酸乙酯萃取部分→浓缩→硅胶柱色谱分离（氯仿-甲醇梯度洗脱）→葡聚糖凝胶柱层析（甲醇洗脱）→缩洗脱液→结晶与重结晶纯化处理→得黄酮化合物单体
• 黄酮类化合物的检识与结构鉴定
  • 黄酮类化合物的检识与结构测定现在多依赖波谱学综合解析，经典的化学方法与色谱法已降至辅助地位；未知黄酮类化合物的一般鉴定过程——利用PC或TLC获得Rf值，与文献比较，分析对比试样在甲醇溶液中及增加各种诊断试剂后所得到的UV-可见光数据，分析试样显色反应及分离过程中行为表现（如水中溶解度、在酸或碱中的溶解情况及铅盐沉淀反应等）；1H-NMR与13C-NMR可确定黄酮母核类型及取代模式，能确切指认每一个信号，目前在黄酮类化合物结构鉴定中发挥重要作用；MS只需微量试样即获得整个分子结构及主要碎片结构，是黄酮类结构鉴定另一重要手段
  • 色谱法在黄酮类化合物鉴别中的应用
    • 纸色谱（PC）：适合于分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物，混合物的鉴定常采用双向纸色谱法，第一向用极性小的“醇性”展开剂，第二向用极性大的“水性”展开剂
      • 黄酮苷元的鉴别：展开剂——一般使用极性相对较小的“醇性溶剂”，如正丁醇-冰醋酸-水（4:1:5上层，BAW）；或用氯仿-醋酸-水（13：6：1）等；Rf值的比较——在醇性展开剂中（分配作用），不同苷元时平面性分子Rf值>非平面型分子，同类型苷元时苷元Rf值>单糖苷>双糖苷，一般苷元>0.7，苷<0.7；显色剂——多数黄酮类化合物在纸色谱（PC）上用紫外光检查时可看到有色斑点，氨蒸汽处理后常产生明显的颜色变化，可用于斑点位置的确定（喷2%AlCl3甲醇溶液（紫外灯下检查）或1%FeCl3-1%K3[Fe(CN)6](1:1) 等显色剂亦可；本显色剂适用于黄酮苷元、黄酮苷及黄酮苷元与黄酮苷的混合物显色，亦用于TLC法）
      • 黄酮苷的鉴别：展开剂——一般使用极性相对较大的“水性溶剂”，如1%HCl水溶液、2-8%HOAc水溶液、3%NaCl水溶液等；显色剂——同黄酮苷元；Rf值的比较——在水性展开剂中（吸附作用，极性大的化合物Rf值大），不同苷元时 平面分子Rf值<非平面分子，同类型苷元时苷元Rf值<单糖苷<双糖苷，苷元原点附近，苷>0.5，糖链越长，Rf越大，苷元顺序是黄酮（醇），查耳酮（Rf<0.02）<二氢黄酮（醇），二氢查耳酮（Rf=0.1-0.3）
    • 薄层色谱（TLC）：用于分离检识弱极性黄酮类化合物较好，分离检识黄酮苷元常用展开剂有甲苯-甲酸甲酯-甲酸（5:4:1，甲苯与甲酸比例可根据情况适当调整），亦可用苯-甲醇（95:5）、甲苯-氯仿-丙酮（40:25:35）等
    • 聚酰胺薄层色谱：特别适合于分离检识含游离酚羟基的黄酮类化合物及其苷类；因聚酰胺对黄酮类化合物吸附能力较强，故需使用极性较强的展开剂，亲脂性有机溶剂，如使用氯仿-甲醇（94:6）、苯-甲醇-丁酮（90:6:4）等展开剂，含水极性溶剂，如使用乙醇-水（3:2）、丙酮-水（1:1）、水饱和正丁醇-醋酸（100:1）等
  • 紫外及可见光谱在黄酮类鉴定中的应用
    • 一般程序：测定试样在甲醇溶液中的UV光谱→测定试样在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后的UV及可见光谱，常用诊断试剂有甲醇钠（CH3ONa）、NaOAc、醋酸钠/硼酸（NaOAc/H3BO3） 、AlCl3、三氯化铝/盐酸（AlCl3/HCl）等→如试样是苷类，则可进行水解或甲基化后再水解，然后测定苷元及其衍生物的UV光谱→对比以上各种光谱图，可获知有关结构信息
    • 黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱特征：多数黄酮类化合物因分子结构中存在着由桂皮酰基与苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故其甲醇溶液在200-400nm区域有两个主要的紫外吸收带，分别称为峰带I与峰带II；峰带I由桂皮酰基引起（300-400nm），主要受B环上取代基影响，峰带II则由苯甲酰基造成（220-280nm），主要受A环上取代基影响；黄酮与黄酮醇——峰带I位置不同，峰带II位置相同，峰带I、峰带 II均强；异黄酮与二氢黄酮（醇）——峰带II位置不同，峰带I位置相近，峰带I弱（肩峰）、峰带II强；查尔酮与橙酮——峰带I位置不同、峰带II位置相同，峰带I强、峰带II次强峰
    • 加入诊断试剂后引起的位移及其在结果测定中的意义
      • NaOMe：黄酮类化合物上所有酚羟基，均可在 NaOMe 中成盐，引起红移，确定4'-OH；检查黄酮（醇）中游离4'-OH，带I+40～60nm，峰强度不下降，示有4'-OH存在，带I+50～60nm，峰强度下降，示有3-OH存在，但无4'-OH；黄酮（醇）中游离 3,4'-OH体系或 3,3'，4'-三OH等对碱敏感的OH产生吸收峰，其强度随时间延长而递减
      • NaOAc（未熔融）：确定7-OH，带II+5~20nm，示有7-OH存在
      • NaOAc（熔融）：醋酸钠(熔融) 碱性提高,表现与NaOMe 类似效果，确定4'-OH，带I红移40～65nm，强度下降，示有4'-OH
      • NaOAc/H3BO3：在NaOAc的碱性存在下，硼酸可与分子中的邻 二酚羟基络合，引起相应吸收带红移，确定邻二酚羟基；黄酮（醇）带I红移12~30nm，示B环具邻二酚羟基，带II红移5~10nm，示A环具邻二酚羟基（除5,6-二OH）
      • AlCl3, AlCl3/HCl ：铝络合物的相对稳定性为黄酮醇3-OH>黄酮5-OH>二氢黄酮5-OH>邻二酚OH>二氢黄酮醇3-OH（邻二酚羟基和二氢黄酮醇3-OH在酸性条件下不与 AlCl3络合，但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络合，形成络合物越稳定，红移越多）；AlCl3/HCl与AlCl3中光谱比较（邻二酚羟基）——AlCl3/HCl谱图= AlCl3谱图，则结构中无邻二酚OH；AlCl3/HCl谱图≠ AlCl3谱图，则结构中可能有邻二酚OH，若B环有邻二酚羟基，则带I紫移30~40nm，若A，B环同时有邻二酚羟基，则带I紫移50~60nm；AlCl3/HCl与MeOH中光谱比较（黄酮醇的3-OH,5-OH）——AlCl3/HCl谱图=MeOH谱图示无3-及/或5-OH；AlCl3/HCl谱图≠MeOH谱图，带I+35~55nm ，示只有5-OH存在，带I+60nm，示只有3-OH存在，带Ⅰ+50~60nm，示有3及5-OH
  • 核磁共振氢谱在黄酮类结构鉴定中的应用
    • 所用溶解溶剂：CDCl3、氘代二甲亚砜（DMSO-d6）、氘代吡啶等；常用溶剂是无水 DMSO-d6，其优点在于不仅溶解范围广，而且各质子信号的分辨率高；若在样品中加入重水（D2O），羟基信号消失（活泼氢）
    • A环质子
      • 5,7-二羟基黄酮类化合物（A环上只有2个芳香质子）：H-6与H-8分别作为二重峰（J=2.5Hz）出现在δ5.70~6.90ppm，且H-6信号较H-8出现在较高场；当C7-OH成苷或甲醚化后， H-6与H-8信号均向低场方向位移
      • 7-羟基黄酮类化合物（A环上有3个芳香质子）：H-5因受C4-羰基强烈负屏蔽效应以及H-6邻偶作用（ J=9.0Hz ），以二重峰出现在低场δ8.0ppm；H-6受H-5邻偶（ J=9.0Hz ）及H-8间偶作用（J=2.5），以双二重峰（dd）出现在δ6.7~7.1；H-8受H-6间偶作用，以二重峰（d）出现
    • B环质子
      • 4'-氧取代黄酮类化合物（该取代模式的B环质子分为两组，H-2'与H-6'一组，另一组是H-3'与H-5'）：两组质子信号出现在δ6.50~7.90区域，大体上处于比A环质子稍低磁场区；H-3'与H-5'组因受C4'-OR 屏蔽作用影响，以及H-2'与H-6'的邻偶作用，表现为双重峰（ δ6.50~7.10，d ）；） H-2'与H-6'组因C环的负屏蔽效应及H-3'与H-5'的邻偶作用，其信号表现为相对更低场的双重峰（ δ7.10~8.10，d ）
      • 3',4'-二氧取代黄酮及黄酮醇（B环质子有3个）：H-5′ 仅受C4'-OR屏蔽作用，以二重峰（d, J=8.5Hz ）出现δ6.70~ 7.10处；H-2′同时受C3'-OR屏蔽作用与C环负屏蔽影响，以二重峰（d, J=2.5Hz ）出现在δ7.20~ 7.90处；H-6′受C环负屏蔽影响，以双二重峰（dd, J=2.5及8.5Hz ）出现在δ7.20~ 7.90；H-2′与H-6′信号有时相互重叠
      • 3',4'-二氧取代异黄酮与二氢黄酮（醇）：H-2'、H-5'、H-6′将作为一个复杂的多重峰(常组成两组峰)出现在δ6.70~7.10处；C环对H-2'、H-5'、H-6′影响很小
      • 3',4',5'-三氧取代黄酮类化合物：当R1=R2=R3=H，则H-2′，H-6′将作为相当于两个质子（-CH2-）的一个单峰，出现在δ6.50~7.50 ppm区域；当C3'-OH或C5'-OH 被甲基化或苷化时，H-2′、 H-6′将分别以不同化学位移作为一个二重峰出现（J=2.0Hz）
    • C环质子：区别各类黄酮化合物的主要依据
      • 黄酮类：H-3作为一个尖锐的单峰（s）出现在δ6.30~6.80ppm 区域
      • 异黄酮类：H-2作为一个单峰（s）出现在比一般芳香质子较低的磁场区（δ7.60~7.80ppm），因为其处于羰基β位，且通过C2与O1相接
      • 二氢黄酮及二氢黄酮醇类：二氢黄酮——H-2因与两个磁不等价的H-3（Ha与He）偶合，以1个双二重峰(dd)出现在δ5.20ppm处；H-3（Ha与He）因彼此偕偶（J=17.0Hz）及与H-2邻偶（Jtrans=11.0Hz；Jcis=5.0Hz），将分别作为一个双二重峰（dd）出现在δ2.80ppm附近，且往往相互重叠；二氢黄酮醇——H-2与H-3多为反式双直立键，H-2以二重峰(d)出现，δ4.8~5.0ppm，H-3以二重峰(d)出现，δ4.1~4.3ppm（H-2与H-3很容易区分）；当C3-OH成苷时，将使H-2、H-3信号向低场方向移动
      • 查耳酮及橙酮类：查耳酮——H-α与H-β 分别以二重峰（d）出现在δ6.7~7.4ppm区域；橙酮（2-苄基苯并呋喃酮）——苄基质子作为一个单峰（s）出现在δ6.5~6.7ppm处
    • 糖上的质子
      • 单糖苷类：糖与苷元相连时，糖分子H-1''通常出现在较低磁场（δ 4.2~6.0），而糖分子中其它氢（H-2''→ H-6 ''）信号在δ3.2~4.2ppm；一般游离糖分子，H-1''常出现在δ4.0ppm；苷元上糖位置不同，糖端基质子的化学位移不同，也与糖的种类有关糖的端基C质子，根据其偶合常数可以确定苷键构型
      • 双糖苷类：黄酮类化合物双糖苷中末端糖（单糖2）上 H-1'''离黄酮母核较远，受苷元负屏蔽影响相对较小，其1H-NMR信号常出现在比H-1''较高的磁场区域，化学位移相对较小；双糖苷中末端糖上H-1'''具体峰位因连接位置不同而异
    • 6-及8-CH3质子：通常C6-CH3氢原子恒定出现在比C8-CH3氢原子小0.2ppm的磁场处
    • 乙酰氧基的质子：脂肪族乙酰氧基上的质子信号通常出现在δ1.65~2.10ppm处，根据脂肪族乙酰氧基上的质子数目往往可以帮助判断黄酮苷中结合糖的数目（因为这样的乙酰基CH3CO-只可能连接在糖分子结构上）；芳香族乙酰氧基上的质子信号通常出现在δ2.30~2.50ppm处，与脂肪族乙酰基上的质子信号很易区分，根据芳香族乙酰氧基上的质子数目，可以帮助确定黄酮苷元上的酚羟基数目（因为这样的乙酰基CH3CO-只能连接在黄酮苷元结构上）
    • 甲氧基上的质子：通常-OCH3上质子出现在δ3.50~4.10区域
  • 核磁共振碳谱在黄酮类化合物结构鉴定中的应用
    • 黄酮类混合骨架类型的判断
      • 13C-NMR中黄酮类中央三碳核的信号特征：根据C环中C=O碳核信号位置确定黄酮骨架——δ174~184ppm，黄酮或黄酮醇或异黄酮，δ188~197ppm，查耳酮或二氢黄酮或二氢黄酮醇；根据C环中C-3核信号的位置确定黄酮骨架——δ104~112(d)，黄酮类，δ122~126(s)，异黄酮类，δ136(s)，黄酮醇类，δ116~128(d)，查耳酮类，δ42.8~44.6(t)，二氢黄酮类，δ71.2(d)，二氢黄酮醇类
    • 黄酮类化合物取代图式的确定方法
      • 取代基位移的影响：A环取代基仅影响A环母核碳信号；B环取代基只对B环母核碳信号产生作用[-OH与-OCH3作为取代基的位移效应，α-C（Zi）信号大幅度向低场位移，邻位β-C（Zo）及对位-C （Zp）向高场位移， 间位C（Zm）幅度很小地向低场方向移动]
      • 5,7-二羟基黄酮类中C-6及C-8信号的特征：大多数C-6(d)及C-8(d)信号出现在δ90.0～100.0ppm，且δC-6>δC-8；C-6与C-8被甲基取代后， C-6与C-8信号将向低场位移6～10ppm，至δ102ppm左右，未被甲基取代者，碳信号基本不变；如C-6与C-8位被结合成糖苷，则C-6与C-8信号均向低场方向移动10ppm
      • 6位取代基和8位取代基的确定
      • B环的取代基图式：通过13C-NMR数据，可确定黄酮化合物的B环到底是2’,4’-二氧取代还是3’,4’-二氧取代，抑或是 3’,5’-二氧取代模式
    • 黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置
      • 糖的苷化位移及端基碳的信号：酚性苷中，糖上端基碳的苷化位移约为+4.0～+6.0ppm；黄酮类双糖苷或低聚糖苷的13C-NMR中，糖的端基碳信号出现在δ98.0～109.0ppm（常与C-6、C-8及C-10混在一起，难以区分）；通过分析糖端基碳的化学位移值，可确定糖的连接位置（即苷化位置），但有例外
      • 苷元的苷化位移：苷元糖苷化后，直接与糖相连的C-1（α-C）信号向高场方向位移，其邻位与对位的C原子则向低场位移，且对位碳原子的位移幅度大并恒定；同一种糖，在黄酮化合物B环上成苷与在A环上成苷相比较，前者苷化位移现象更明显；比较苷与苷元中相应碳原子的化学位移，可判断糖在苷元上的连接位置
    • 双糖苷及低聚糖苷中分子内苷键及糖的连接顺序：黄酮类单糖苷其糖部分的碳信号可依据单糖及其甲基苷的数据进行比较解析；黄酮双糖苷与三糖苷的光谱则可以通过分解成相应的单糖苷或双糖苷的光谱进行比较而予以鉴定，当糖上的羟基被苷化时，将使该-OH所在碳原子产生一个相当大的低场位移
  • 质谱在黄酮类结构测定中的应用
    • 多数黄酮类化合物苷元在EI-MS中，分子离子峰[M]+较强，往往成为基峰，无需制成衍生物即可进行测定；极性强、难汽化及对热不稳定的黄酮苷常需制备成该黄酮苷的甲基化或三甲基硅烷衍生物，否则在EI-MS中无分子离子峰[M]+ ；黄酮类-O-糖苷类化合物用FAB-MS、ESI-MS与FD-MS等可获得非常强的[M]+
    • 黄酮类化合物苷元的电子轰击质谱（EI-MS）
      • 除分子离子峰[M]+.外，常生成[M-1]+，即（M-H）基峰，如测试样品为黄酮类苷元的甲基化衍生物，则可得到[M-15]+峰，即（M-CH3）碎片离子
      • 黄酮类化合物的两种基本裂解途径：两种途径所得碎片离子均保留了A环及B环的基本骨架，且碎片离子峰的质荷比之和等于[M]+.，在鉴定工作中很有意义
      • 黄酮类化合物的质谱
        • 基本裂解途径以途径Ⅰ为主
        • 多数黄酮苷元分子离子峰[M]+.很强，往往成为基峰：由分子离子峰[M]+.可生成[M-1]+（M-H）与[M-28]+.（M-CO）离子，由[M]+.经RDA途径生成A1+.与B1+.， A1+.与B1+.及[M-28]+.离子峰也很突出，A1+.与B2+.进一步裂解则生成[A1-28] +.（A1-CO）与[B2-28] +.（B2-CO）碎片离子
        • 黄酮苷元A环与B环的取代模式，可以通过分析A1+.与B1+.的m/z来确定
        • C-6及C-8位含-OCH3黄酮的裂解途径：裂解过程中可失去CH3•，得到[M-15]+.强峰（常作为基峰）,随后又失去CO，生成[M-43]+.
      • 黄酮醇类质谱
        • 多数黄酮醇苷元，分子离子峰[M]+.是基峰，在裂解时主要按途径Ⅱ进行，得到B2+离子及继续失去CO形成的[B2-28]+离子，其在鉴定工作中具重要意义；[A1+ H]+是来源于黄酮醇分子A环的主要离子，其上转移的H来自于3-OR基团
        • B2+离子来源于黄酮醇分子的B环，通过分析B2+离子的m/z可判断B环的取代模式
        • 具2′-OH或 2′-OCH3黄酮醇类的裂解特点：通过失去•OH或•OCH3，形成一个新的稳定五元杂环
    • 黄酮苷类化合物的FD-MS
      • 黄酮苷类化合物EI-MS谱图特征：既无分子离子峰[M]+. ，也不显示糖基碎片；有时黄酮苷类化合物的EI-MS与对应黄酮苷元的EI-MS谱图一致
      • FD-MS测定黄酮苷类化合物的优势：具明显M +.及准分子离子[M+H]+（基峰）；能给出糖基的碎片
      • 黄酮苷类化合物FD-MS谱图特征：特别明显的分子离子峰[M +. ]（m/z 594.2）与准分子离子[M+H]+（m/z 595.1）；明显的[M+ 23Na]+ （m/z 617.3）离子；可见苷元碎片峰（m/z 299.9）；因苷中糖链间或糖分子内部开裂形成的某些糖基碎片（ m/z 462、150等）亦可见；在FD-MS中，因[M+ 23Na]+离子的强度随溶剂极性及发射丝电流强度的改变而有不同，故可用于鉴别分子离子峰[M]+及准分子离子峰[M+1]+，免受[M+ 23Na]+离子峰的干扰
  • 黄酮类化合物的立体化学问题
    • 范畴主要涉及二氢黄酮、二氢黄酮醇及二氢异黄酮类的C-2、C-3之立体化学问题；测定绝对构型的方法有化学法、X射线单晶衍射法、核磁共振法和圆二色光谱法（CD）
    • 二氢黄酮
      • 主要结构特征：C2-C3为单键；C2为手性碳原子，其绝对构型有S、R两种，自然界主要存在2S-构型的二氢黄酮
      • 二氢黄酮C-2绝对构型与CD谱的关系：二氢黄酮在300~340nm有紫外吸收，这是C环上羰基的n→П*跃迁所引起；CD显示正Cotton效应，C2绝对构型为S；CD显示负Cotton效应，则C2绝对构型为R
    • 二氢黄酮醇
      • 主要结构特征：C2-C3为单键；有C2、C3两个手性中心，存在四种立体构型（2R，3R）、（2S，3S）、 （2R，3S）和 （2S，3R），自然界中以（2R，3R）构型的二氢黄酮醇最为常见
      • 二氢黄酮醇C-2、C-3绝对构型的确立
        • 根据1H-NMR偶合常数J2,3判断C-2、C-3的相对构型：若J2,3=11Hz，则H-2与H-3为反式构型，若J2,3= 3Hz，则H-2与H-3为顺式构型；当H-2与H-3为反式双直立键时，构型比较稳定，其绝对构型可能是（2R，3R）或 （2S，3S）；对于顺式构型，当H-2处于直立键而H-3为平伏键时，构型比较稳定，其绝对构型可能是（2R，3S）或 （2S，3R）
        • 根据CD谱线的符号判断C-2的绝对构型，从而推定C-3的绝对构型：当显示正Cotton效应时，判断C-2的绝对构型为R-构型；当显示负Cotton效应时，判断C-2的绝对构型为S-构型
    • 二氢异黄酮
      • 二氢异黄酮在320~352nm有紫外吸收，这是C环上羰基的n→П*跃迁所引起
      • 当CD谱图显示正Cotton效应时，可以推定C3绝对构型为R；当CD谱图显示负Cotton效应，则C3绝对构型为S
  • 结构研究实例
    • 苦参醇A（kushenol A）的结构测定
    • 千斤拔苷A（flemingoside A）的结构测定
• 黄酮类化合物的生物活性
  • 对心血管系统的作用
    • 不少治疗冠心病有效的中草药或活血化瘀类中药均含有黄酮类化合物；芦丁、槲皮素、葛根素等均有明显的扩冠作用，已用于临床
  • 保肝作用
    • 从水飞蓟种子中得到的水飞蓟宾、异水飞蓟素等黄酮类化合物已被证明具很强保肝作用，临床用以治疗急、慢性肝炎等；儿茶素在欧洲可用作抗肝脏毒药物；黄芩苷降低氨基转移酶的疗效较好，临床上主要用于治疗急性、慢性迁延性和慢性活动性肝炎等
  • 抗炎作用
    • 具有抗炎作用的黄酮类化合物；黄酮类化合物的抗炎作用可能与前列腺素生物合成过程中的脂氧合酶受抑制有关；羟乙基芦丁及棉花皮苷对胃溃疡有治疗及预防作用
  • 雌性激素样作用
    • 染料木素、鹰嘴豆芽素A及大豆素等异黄酮类均有雌性激素样作用，这可能是由于它们与己烯雌酚结构相似的缘故；大豆异黄酮可用于防治一些和雌激素水平不平衡有关的疾病，如更年期综合征、骨质疏松等
  • 抗氧化作用
    • 含多个酚羟基结构的黄酮类化合物，如山奈酚、槲皮素、木犀草素、儿茶素等，具抗氧化作用；机理——通过抗脂质过氧化、清除活性自由基、对体内酶作用等发挥抗氧化作用
  • 抗菌及抗病毒作用
    • 木犀草素、黄芩苷、黄芩素等具一定程度的抗菌作用；大豆素、染料木苷、甘草素等异黄酮类对HIV病毒有一定抑制作用；儿茶素类具有治疗尖锐湿疣的作用，以绿茶茶多酚（主要是儿茶素）研制的Veregen是FDA批准的第一个植物药
  • 抗肿瘤作用
    • 槲皮素、黄芩素、葛根异黄酮与大豆素等具抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用；芹菜素、染料木苷等显示出对癌症的化学预防作用
  • 降糖作用
    • 根皮苷具较强降糖作用，但因其选择性不高及在肠道迅速水解成根皮素与葡萄糖，故根皮苷本身不能药用；以根皮苷为先导化合物开发的降血糖药物坎格列净，临床用于治疗2型糖尿病，是以天然活性产物为先导物研制成功的范例
  • 其他作用
    • 异甘草素、大豆素等具有类似于罂粟碱的解除平滑肌痉挛样作用；大豆苷、葛根黄素等可缓解高血压患者的头痛等症状